經(jīng)熊去氧膽酸治療妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥孕婦血清膽汁酸譜分析Δ

凌玲，劉兆明，邵勇#，王富蘭(1.重慶市紅十字會(huì)醫(yī)院，重慶市40000；.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，重慶市400016)

妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥(Intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP)是妊娠期特有的并發(fā)癥。ICP對胎兒影響較大，可發(fā)生胎兒窘迫和妊娠晚期不可預(yù)測的胎兒突然死亡。目前治療ICP的主要藥物是熊去氧膽酸(Ursodeoxycholic acid，UDCA)和腺苷蛋氨酸(S-adenosy-L-methione，SAMe)。國外大多推薦UDCA作為治療的一線藥物[1]。ICP最顯著的生化異常是血清中膽汁酸水平升高。人體內(nèi)代謝的膽汁酸主要為5類游離型膽汁酸，即膽酸(Cholic acid，CA)、鵝去氧膽酸(Chenodeoxycholic acid，CDCA)、去氧膽酸(Deoxycholic acid，DCA)、石膽酸(Lithocholic acid，LCA)和UDCA以及它們的甘氨(Glyco-，G)和牛磺(Tauro-，T)結(jié)合型膽汁酸[2]。ICP孕婦妊娠中晚期血清總膽汁酸明顯升高，其中以甘氨膽酸(GCA)和牛磺膽酸(TCA)為主的結(jié)合型膽汁酸升高最為顯著，游離型膽汁酸變化不大[3，4]。本研究采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(High performance liquid chromatography-tendem mass spectrometry，HPLC-MS/MS)法檢測UDCA治療ICP孕婦的血清膽汁酸譜的變化，為臨床的決策提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

API2000 HPLC-MS/MS儀，配備Perkin Elmer200泵和tubro離子源(加拿大Applied Biosystems公司)；Miliolpore真空泵和Waters part No WaT086344型吹氮裝置(美國Waters公司)；DL-1型固相萃取器(國家色譜研究分析中心)；LD5-2A離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)；SZ-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)；Libroafl-200天平(日本Shimadzu公司)；SB-3200超聲波清洗器(寧波新芝科器研究所)；Modular 800全自動(dòng)生化分析儀(瑞士羅氏公司)。

1.2 試藥

CA標(biāo)準(zhǔn)品(批號:81-25-4，純度≥98%)、CDCA標(biāo)準(zhǔn)品(批號:83-44-3，純度≥99%)、?；鞘懰?TLCA)標(biāo)準(zhǔn)品(批號:345909-26-4，純度≥95%)、LCA標(biāo)準(zhǔn)品(批號:434-13-9，純度≥97%)、UDCA標(biāo)準(zhǔn)品(批號:128-13-2，純度≥99%)、GCA標(biāo)準(zhǔn)品(批號:1192657-83-2，純度≥97%)、TCA標(biāo)準(zhǔn)品(批號:345908-23-1，純度≥95%)均購自美國Sigma-aldrich公司；甲醇、甲酸、乙腈、醋酸銨均為色譜純。

2 方法

2.1 色譜及質(zhì)譜條件[5]

色譜柱:菲羅門pH1-12柱(100 mm×2 mm，3 μm)；預(yù)柱:Luna C18(10 mm×2.0 mm，3 μm)；流動(dòng)相:1/200乙酸水溶液(用氨水調(diào)節(jié)pH值至4.5)∶甲醇＝30∶70；流速:0.20 mL·min－1；柱溫:35℃。

電噴霧電離源(ESI)選擇性正離子檢測，選擇離子模式(SIM)方式檢測；干燥氮?dú)鉁囟?200℃，霧化器流量:1.5 L·min－1；檢測電壓:1.40 kV。

2.2 研究對象

ICP組20例，正常對照組15例。所有ICP孕婦分別于治療前及治療后4周采集空腹靜脈血5 mL，裝于無菌普通生化管內(nèi)，立即將新鮮靜脈血標(biāo)本在常溫、普通氣壓下3000 r·min－1離心15 min，吸取血清2 mL至凍存管內(nèi)，放入－70℃低溫冰箱內(nèi)凍存。檢測血清膽汁酸譜、甘膽酸和肝功能。本研究標(biāo)本采集獲得重慶醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和受試者知情同意。

2.3 ICP診斷及納入、排除標(biāo)準(zhǔn)[6]

2.3.1 ICP診斷及納入標(biāo)準(zhǔn):妊娠中晚期出現(xiàn)軀干、四肢等皮膚瘙癢，可伴或不伴黃疸；血清總膽汁酸(TBA)升高(＞10 μmol·L－1)，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)輕至中度升高(＞50 U·L－1)，總膽紅素(TBIL)及直接膽紅素(DBIL)正?；蛏?。

2.3.2 排除標(biāo)準(zhǔn):肝膽B(tài)超排除肝膽疾??；乙肝病毒、丙肝病毒、巨細(xì)胞病毒和EB病毒標(biāo)志物檢查排除病毒性肝炎；排除合并其他疾病者；分娩后上述癥狀、體征、生化指標(biāo)迅速恢復(fù)正常。

2.4 ICP治療方案

所有ICP患者孕期26～32周入組，進(jìn)入本研究前未行ICP藥物治療。治療前及治療4周后分別檢測肝功能和膽汁酸譜。ICP組患者口服UDCA(德國Losan Pharma GmbH公司，規(guī)格:每粒250 mg)250 mg，每日4次，2周為1個(gè)療程，本試驗(yàn)共進(jìn)行2個(gè)療程(4周)。治療前及治療后4周分別檢測肝功能和膽汁酸譜。HPLC-MS/MS檢測7種膽汁酸:CA、GCA、TLCA、TCA、UDCA、LCA、CDCA。

2.5 樣品預(yù)處理與測定[5]

取血清300 μL于1.5 mL離心管中，加入乙腈溶液700 μL，渦旋振蕩30 s，3000 r·min－1離心5 min，吸取上清液，吹干，加0.05%甲酸1.0 mL混合，用C18固相萃取柱萃取。用甲醇洗脫，60℃下氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)眉状?00 μL溶解，混勻，高速(15000 r·min－1)離心1.5 min。取20 μL進(jìn)樣分析，檢測時(shí)間10 min。

2.6 方法學(xué)驗(yàn)證

方法學(xué)驗(yàn)證已有文獻(xiàn)報(bào)道[5]。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所得數(shù)據(jù)輸入SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 ICP治療組和正常對照組一般情況分析

ICP治療組年齡(29.18±1.97)歲，正常對照組年齡(28.14±2.98)歲，2組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

3.2 ICP治療前、后孕婦血清肝功能指標(biāo)分析

ICP治療前與正常對照組相比較，TBA、ALT、AST、TBIL、DBIL有不同程度的升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；ICP治療前與ICP治療后比較ALT、AST、TBIL、DBIL顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

3.3 ICP治療前、后孕婦血清膽汁酸譜比較分析

ICP患者治療前的血清膽汁酸譜CA、GCA、TCA、LCA和TLCA分別為:(3.7±0.35)、(4.2±0.64)、(8.4±1.73)、(0.13±0.02)、(0.09±0.02)μmol·L－1，顯著高于正常對照組的(0.41±0.03)、(0.94±0.02)、(0.69±0.17)、(0.06±0.02)、(0.04±0.02)μmol·L－1，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；經(jīng)UDCA治療后，CA和GCA下降至(1.29±0.17)、(1.86±0.47)μmol·L－1(P＜0.05)，TLCA和TCA顯著下降至(0.02±0.01)、(1.16±0.33)μmol·L－1(P＜0.01)，LCA無顯著下降，而UDCA與治療前比較升高了10倍(P＜0.01)；ICP經(jīng)UDCA治療后與正常對照組比較，UDCA極顯著升高(P＜0.01)，CA、GCA、TCA分別有不同程度升高(P＜0.05)。ICP治療前、后孕婦血清膽汁酸譜分析見表1。

表1 ICP治療前、后孕婦血清膽汁酸譜分析(μmol·L－1，±s )Tab 1Serum bile acid chromatograms of ICPbefore and after treatmen(tμmol·L－1，±s )

表1 ICP治療前、后孕婦血清膽汁酸譜分析(μmol·L－1，±s )Tab 1Serum bile acid chromatograms of ICPbefore and after treatmen(tμmol·L－1，±s )

ICP治療前與正常對照組比較:＊P＜0.01，＃P＜0.05；ICP治療前與ICP治療后比較:☆P＜0.01，ΔP＜0.05；ICP治療后與正常對照組比較:◆P＜0.01，□P＜0.05before treatment vs.control group:＊P＜0.01，＃P＜0.05；before treatment vs.after treatment:☆P＜0.01，ΔP＜0.05；after treatment vs.control group:◆P＜0.01，□P＜0.05

TCA 8.40±1.73＊☆1.16±0.33□0.69±0.17組別ICP治療前ICP治療后正常對照組例數(shù)/n 202015 LCA 0.13±0.02＃0.09±0.030.06±0.02 UDCA 0.32±0.03☆3.19±0.43◆0.25±0.13 CDCA 0.43±0.010.37±0.140.35±0.02 CA 3.70±0.35＊Δ 1.29±0.17□0.41±0.03 GCA 4.2±0.64＊Δ 1.86±0.47□0.94±0.02 TLCA 0.09±0.02?！?.02±0.010.04±0.02

3.4 妊娠結(jié)局分析

與正常對照組相比，ICP治療組的羊水糞染率顯著升高(P＜0.05)；早產(chǎn)率和Apgar評分≤7，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。本研究均無圍生兒死亡發(fā)生。

4 討論

ICP藥物治療目標(biāo)是緩解瘙癢癥狀，降低血膽酸濃度，改善肝功能，從而降低高膽酸血癥所致的胎兒窘迫和死胎的發(fā)生。UDCA通過內(nèi)源性膽汁酸競爭，降低膽酸，改善胎兒環(huán)境從而延長胎齡，減輕瘙癢癥狀和降低生化指標(biāo)，在膽汁中最具親水性，其治療ICP的機(jī)制主要有3方面:(1)保護(hù)膽管細(xì)胞免受疏水酸的細(xì)胞毒性作用，降低膽汁中膽汁酸的細(xì)胞毒性，降低膽管中疏水酸的濃度；(2)促進(jìn)肝膽管的分泌，促進(jìn)肝細(xì)胞膜上轉(zhuǎn)運(yùn)器的攜帶、轉(zhuǎn)運(yùn)功能；(3)保護(hù)肝細(xì)胞拮抗膽汁酸所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，抑制線粒體膜的轉(zhuǎn)運(yùn)通透性，增加其主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的能力[7～9]。Tribe等[2]研究發(fā)現(xiàn)，UDCA可以改善?；切秃透拾毙褪杷阅懼岬霓D(zhuǎn)運(yùn)途徑，從而使外周血中的?；切秃透拾毙褪杷阅懼峤档?，減少肝細(xì)胞的損害，降低細(xì)胞的毒性作用。在本研究中，ICP患者接受UDCA治療后與治療前比較血清CA、GCA、TCA、TLCA均明顯下降。ICP治療前孕婦血清UDCA與正常對照組比較無明顯升高，但是經(jīng)UDCA治療后，由于外源性UDCA的增加，治療后UDCA水平明顯升高，與正常對照組比較，差異具有顯著性(P＜0.01)。Brites等[10]研究發(fā)現(xiàn)，與正常妊娠孕婦相比，ICP治療前后LCA的濃度維持不變，但是LCA比例從(3.3±0.5)%增加到(7.4±1.3)%。與此不同的是，Lucangioli等[11]發(fā)現(xiàn)UDCA治療的ICP患者LCA和TBA濃度降低了，未接受UDCA治療的患者LCA濃度未改變，故認(rèn)為LCA是更好的評價(jià)UDCA治療ICP效果的指標(biāo)。在本研究中，ICP患者與正常對照組比較，LCA和TLCA均明顯升高，但在UDCA治療后TLCA明顯下降，LCA則無顯著下降。

ICP時(shí)，由于孕婦高膽汁酸血癥，膽汁酸鹽沉積于胎盤，胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞毒性改變，胎兒體內(nèi)產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物如膽汁酸通過胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)到母體的功能受到影響，而且母體血中呈高濃度膽汁酸狀態(tài)，使得膽汁酸由母體進(jìn)入胎兒體內(nèi)，胎兒血液中的膽汁酸水平異常聚集升高，膽汁酸可以通過被動(dòng)擴(kuò)散和鈉依賴載體主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入胎兒細(xì)胞內(nèi)，可能引起胎兒細(xì)胞毒性改變[12]。大量臨床研究發(fā)現(xiàn)，ICP孕婦血液中膽汁酸水平愈高，胎兒窘迫發(fā)生率亦愈高。由此可見，膽汁酸對胎兒的不良影響是明顯的。UDCA通過降低母體血的高膽汁酸水平，減少了胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的毒性改變，從而改善胎兒環(huán)境，延長胎齡。在本研究中，ICP治療組的早產(chǎn)率和Apgar評分≤7，與正常對照組相比無差別，提示積極治療可以改善ICP患者圍生兒的預(yù)后。

本研究表明，UDCA治療ICP后，能顯著地降低ICP患者的高膽汁酸水平，其中CA、GCA、TCA、TLCA水平下降最為明顯。

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