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    經(jīng)熊去氧膽酸治療妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥孕婦血清膽汁酸譜分析Δ

    2011-08-07 01:26:02凌玲劉兆明邵勇王富蘭重慶市紅十字會(huì)醫(yī)院重慶市40000重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院重慶市400016
    中國藥房 2011年26期
    關(guān)鍵詞:膽酸膽汁酸純度

    凌玲,劉兆明,邵勇#,王富蘭(1.重慶市紅十字會(huì)醫(yī)院,重慶市40000;.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院,重慶市400016)

    妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥(Intrahepatic cholestasis of pregnancy,ICP)是妊娠期特有的并發(fā)癥。ICP對胎兒影響較大,可發(fā)生胎兒窘迫和妊娠晚期不可預(yù)測的胎兒突然死亡。目前治療ICP的主要藥物是熊去氧膽酸(Ursodeoxycholic acid,UDCA)和腺苷蛋氨酸(S-adenosy-L-methione,SAMe)。國外大多推薦UDCA作為治療的一線藥物[1]。ICP最顯著的生化異常是血清中膽汁酸水平升高。人體內(nèi)代謝的膽汁酸主要為5類游離型膽汁酸,即膽酸(Cholic acid,CA)、鵝去氧膽酸(Chenodeoxycholic acid,CDCA)、去氧膽酸(Deoxycholic acid,DCA)、石膽酸(Lithocholic acid,LCA)和UDCA以及它們的甘氨(Glyco-,G)和牛磺(Tauro-,T)結(jié)合型膽汁酸[2]。ICP孕婦妊娠中晚期血清總膽汁酸明顯升高,其中以甘氨膽酸(GCA)和牛磺膽酸(TCA)為主的結(jié)合型膽汁酸升高最為顯著,游離型膽汁酸變化不大[3,4]。本研究采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(High performance liquid chromatography-tendem mass spectrometry,HPLC-MS/MS)法檢測UDCA治療ICP孕婦的血清膽汁酸譜的變化,為臨床的決策提供依據(jù)。

    1 材料

    1.1 儀器

    API2000 HPLC-MS/MS儀,配備Perkin Elmer200泵和tubro離子源(加拿大Applied Biosystems公司);Miliolpore真空泵和Waters part No WaT086344型吹氮裝置(美國Waters公司);DL-1型固相萃取器(國家色譜研究分析中心);LD5-2A離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠);SZ-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠);Libroafl-200天平(日本Shimadzu公司);SB-3200超聲波清洗器(寧波新芝科器研究所);Modular 800全自動(dòng)生化分析儀(瑞士羅氏公司)。

    1.2 試藥

    CA標(biāo)準(zhǔn)品(批號:81-25-4,純度≥98%)、CDCA標(biāo)準(zhǔn)品(批號:83-44-3,純度≥99%)、?;鞘懰?TLCA)標(biāo)準(zhǔn)品(批號:345909-26-4,純度≥95%)、LCA標(biāo)準(zhǔn)品(批號:434-13-9,純度≥97%)、UDCA標(biāo)準(zhǔn)品(批號:128-13-2,純度≥99%)、GCA標(biāo)準(zhǔn)品(批號:1192657-83-2,純度≥97%)、TCA標(biāo)準(zhǔn)品(批號:345908-23-1,純度≥95%)均購自美國Sigma-aldrich公司;甲醇、甲酸、乙腈、醋酸銨均為色譜純。

    2 方法

    2.1 色譜及質(zhì)譜條件[5]

    色譜柱:菲羅門pH1-12柱(100 mm×2 mm,3 μm);預(yù)柱:Luna C18(10 mm×2.0 mm,3 μm);流動(dòng)相:1/200乙酸水溶液(用氨水調(diào)節(jié)pH值至4.5)∶甲醇=30∶70;流速:0.20 mL·min-1;柱溫:35℃。

    電噴霧電離源(ESI)選擇性正離子檢測,選擇離子模式(SIM)方式檢測;干燥氮?dú)鉁囟?200℃,霧化器流量:1.5 L·min-1;檢測電壓:1.40 kV。

    2.2 研究對象

    ICP組20例,正常對照組15例。所有ICP孕婦分別于治療前及治療后4周采集空腹靜脈血5 mL,裝于無菌普通生化管內(nèi),立即將新鮮靜脈血標(biāo)本在常溫、普通氣壓下3000 r·min-1離心15 min,吸取血清2 mL至凍存管內(nèi),放入-70℃低溫冰箱內(nèi)凍存。檢測血清膽汁酸譜、甘膽酸和肝功能。本研究標(biāo)本采集獲得重慶醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和受試者知情同意。

    2.3 ICP診斷及納入、排除標(biāo)準(zhǔn)[6]

    2.3.1 ICP診斷及納入標(biāo)準(zhǔn):妊娠中晚期出現(xiàn)軀干、四肢等皮膚瘙癢,可伴或不伴黃疸;血清總膽汁酸(TBA)升高(>10 μmol·L-1),丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)輕至中度升高(>50 U·L-1),總膽紅素(TBIL)及直接膽紅素(DBIL)正?;蛏?。

    2.3.2 排除標(biāo)準(zhǔn):肝膽B(tài)超排除肝膽疾??;乙肝病毒、丙肝病毒、巨細(xì)胞病毒和EB病毒標(biāo)志物檢查排除病毒性肝炎;排除合并其他疾病者;分娩后上述癥狀、體征、生化指標(biāo)迅速恢復(fù)正常。

    2.4 ICP治療方案

    所有ICP患者孕期26~32周入組,進(jìn)入本研究前未行ICP藥物治療。治療前及治療4周后分別檢測肝功能和膽汁酸譜。ICP組患者口服UDCA(德國Losan Pharma GmbH公司,規(guī)格:每粒250 mg)250 mg,每日4次,2周為1個(gè)療程,本試驗(yàn)共進(jìn)行2個(gè)療程(4周)。治療前及治療后4周分別檢測肝功能和膽汁酸譜。HPLC-MS/MS檢測7種膽汁酸:CA、GCA、TLCA、TCA、UDCA、LCA、CDCA。

    2.5 樣品預(yù)處理與測定[5]

    取血清300 μL于1.5 mL離心管中,加入乙腈溶液700 μL,渦旋振蕩30 s,3000 r·min-1離心5 min,吸取上清液,吹干,加0.05%甲酸1.0 mL混合,用C18固相萃取柱萃取。用甲醇洗脫,60℃下氮?dú)獯蹈?,殘?jiān)眉状?00 μL溶解,混勻,高速(15000 r·min-1)離心1.5 min。取20 μL進(jìn)樣分析,檢測時(shí)間10 min。

    2.6 方法學(xué)驗(yàn)證

    方法學(xué)驗(yàn)證已有文獻(xiàn)報(bào)道[5]。

    2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    所得數(shù)據(jù)輸入SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示,采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用率表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3 結(jié)果

    3.1 ICP治療組和正常對照組一般情況分析

    ICP治療組年齡(29.18±1.97)歲,正常對照組年齡(28.14±2.98)歲,2組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    3.2 ICP治療前、后孕婦血清肝功能指標(biāo)分析

    ICP治療前與正常對照組相比較,TBA、ALT、AST、TBIL、DBIL有不同程度的升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);ICP治療前與ICP治療后比較ALT、AST、TBIL、DBIL顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

    3.3 ICP治療前、后孕婦血清膽汁酸譜比較分析

    ICP患者治療前的血清膽汁酸譜CA、GCA、TCA、LCA和TLCA分別為:(3.7±0.35)、(4.2±0.64)、(8.4±1.73)、(0.13±0.02)、(0.09±0.02)μmol·L-1,顯著高于正常對照組的(0.41±0.03)、(0.94±0.02)、(0.69±0.17)、(0.06±0.02)、(0.04±0.02)μmol·L-1,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);經(jīng)UDCA治療后,CA和GCA下降至(1.29±0.17)、(1.86±0.47)μmol·L-1(P<0.05),TLCA和TCA顯著下降至(0.02±0.01)、(1.16±0.33)μmol·L-1(P<0.01),LCA無顯著下降,而UDCA與治療前比較升高了10倍(P<0.01);ICP經(jīng)UDCA治療后與正常對照組比較,UDCA極顯著升高(P<0.01),CA、GCA、TCA分別有不同程度升高(P<0.05)。ICP治療前、后孕婦血清膽汁酸譜分析見表1。

    表1 ICP治療前、后孕婦血清膽汁酸譜分析(μmol·L-1,±s )Tab 1Serum bile acid chromatograms of ICPbefore and after treatmen(tμmol·L-1,±s )

    表1 ICP治療前、后孕婦血清膽汁酸譜分析(μmol·L-1,±s )Tab 1Serum bile acid chromatograms of ICPbefore and after treatmen(tμmol·L-1,±s )

    ICP治療前與正常對照組比較:*P<0.01,#P<0.05;ICP治療前與ICP治療后比較:☆P<0.01,ΔP<0.05;ICP治療后與正常對照組比較:◆P<0.01,□P<0.05before treatment vs.control group:*P<0.01,#P<0.05;before treatment vs.after treatment:☆P<0.01,ΔP<0.05;after treatment vs.control group:◆P<0.01,□P<0.05

    TCA 8.40±1.73*☆1.16±0.33□0.69±0.17組別ICP治療前ICP治療后正常對照組例數(shù)/n 202015 LCA 0.13±0.02#0.09±0.030.06±0.02 UDCA 0.32±0.03☆3.19±0.43◆0.25±0.13 CDCA 0.43±0.010.37±0.140.35±0.02 CA 3.70±0.35*Δ 1.29±0.17□0.41±0.03 GCA 4.2±0.64*Δ 1.86±0.47□0.94±0.02 TLCA 0.09±0.02?!?.02±0.010.04±0.02

    3.4 妊娠結(jié)局分析

    與正常對照組相比,ICP治療組的羊水糞染率顯著升高(P<0.05);早產(chǎn)率和Apgar評分≤7,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究均無圍生兒死亡發(fā)生。

    4 討論

    ICP藥物治療目標(biāo)是緩解瘙癢癥狀,降低血膽酸濃度,改善肝功能,從而降低高膽酸血癥所致的胎兒窘迫和死胎的發(fā)生。UDCA通過內(nèi)源性膽汁酸競爭,降低膽酸,改善胎兒環(huán)境從而延長胎齡,減輕瘙癢癥狀和降低生化指標(biāo),在膽汁中最具親水性,其治療ICP的機(jī)制主要有3方面:(1)保護(hù)膽管細(xì)胞免受疏水酸的細(xì)胞毒性作用,降低膽汁中膽汁酸的細(xì)胞毒性,降低膽管中疏水酸的濃度;(2)促進(jìn)肝膽管的分泌,促進(jìn)肝細(xì)胞膜上轉(zhuǎn)運(yùn)器的攜帶、轉(zhuǎn)運(yùn)功能;(3)保護(hù)肝細(xì)胞拮抗膽汁酸所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,抑制線粒體膜的轉(zhuǎn)運(yùn)通透性,增加其主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的能力[7~9]。Tribe等[2]研究發(fā)現(xiàn),UDCA可以改善?;切秃透拾毙褪杷阅懼岬霓D(zhuǎn)運(yùn)途徑,從而使外周血中的?;切秃透拾毙褪杷阅懼峤档?,減少肝細(xì)胞的損害,降低細(xì)胞的毒性作用。在本研究中,ICP患者接受UDCA治療后與治療前比較血清CA、GCA、TCA、TLCA均明顯下降。ICP治療前孕婦血清UDCA與正常對照組比較無明顯升高,但是經(jīng)UDCA治療后,由于外源性UDCA的增加,治療后UDCA水平明顯升高,與正常對照組比較,差異具有顯著性(P<0.01)。Brites等[10]研究發(fā)現(xiàn),與正常妊娠孕婦相比,ICP治療前后LCA的濃度維持不變,但是LCA比例從(3.3±0.5)%增加到(7.4±1.3)%。與此不同的是,Lucangioli等[11]發(fā)現(xiàn)UDCA治療的ICP患者LCA和TBA濃度降低了,未接受UDCA治療的患者LCA濃度未改變,故認(rèn)為LCA是更好的評價(jià)UDCA治療ICP效果的指標(biāo)。在本研究中,ICP患者與正常對照組比較,LCA和TLCA均明顯升高,但在UDCA治療后TLCA明顯下降,LCA則無顯著下降。

    ICP時(shí),由于孕婦高膽汁酸血癥,膽汁酸鹽沉積于胎盤,胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞毒性改變,胎兒體內(nèi)產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物如膽汁酸通過胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)到母體的功能受到影響,而且母體血中呈高濃度膽汁酸狀態(tài),使得膽汁酸由母體進(jìn)入胎兒體內(nèi),胎兒血液中的膽汁酸水平異常聚集升高,膽汁酸可以通過被動(dòng)擴(kuò)散和鈉依賴載體主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入胎兒細(xì)胞內(nèi),可能引起胎兒細(xì)胞毒性改變[12]。大量臨床研究發(fā)現(xiàn),ICP孕婦血液中膽汁酸水平愈高,胎兒窘迫發(fā)生率亦愈高。由此可見,膽汁酸對胎兒的不良影響是明顯的。UDCA通過降低母體血的高膽汁酸水平,減少了胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的毒性改變,從而改善胎兒環(huán)境,延長胎齡。在本研究中,ICP治療組的早產(chǎn)率和Apgar評分≤7,與正常對照組相比無差別,提示積極治療可以改善ICP患者圍生兒的預(yù)后。

    本研究表明,UDCA治療ICP后,能顯著地降低ICP患者的高膽汁酸水平,其中CA、GCA、TCA、TLCA水平下降最為明顯。

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