反義寡脫氧核苷酸抑制多藥耐藥基因mdr1表達(dá)并逆轉(zhuǎn)耐藥肝癌細(xì)胞的體外試驗研究

彭志平，蔣明東，尹曉玲，文明，李少林（重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，重慶市400016）

化學(xué)藥物治療是臨床上肝癌治療的重要手段之一，但存在于腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥（Multidrug resistance，MDR）機制卻嚴(yán)重阻礙了化療藥物的療效[1]。研究[2]表明，多藥耐藥基因mdr1及其編碼蛋白過度表達(dá)是肝癌細(xì)胞產(chǎn)生MDR的一條重要途徑。因此，從基因水平研究抑制mdr1基因的表達(dá)來逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞MDR，以期增加腫瘤化療的敏感性是非常必要的。在本研究中，筆者以mdr1基因為靶點，設(shè)計并合成寡脫氧核苷酸（ODN），其中ODN分為反義ODN（ASODN）和正義ODN（SODN），從體外培養(yǎng)耐阿霉素（ADM）肝癌細(xì)胞HepG2/ADM來觀察ASODN對其mdr1基因表達(dá)及化療藥物抑制肝癌細(xì)胞增殖的影響，探討ASODN逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞MDR的可行性。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Thermo Forma細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國賽默飛公司）；超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；480型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（美國PE公司）；Fotodyne 60-2107型凝膠成像系統(tǒng)（美國Image公司）；550型全自動酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）；752型紫外分光光度計（上海第三分析儀器廠）。

1.2 試藥

逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）試劑盒及DNA分子量標(biāo)記X174HincⅡ digest Maker（日本Takara公司）；總RNA抽提試劑盒和轉(zhuǎn)染試劑盒（轉(zhuǎn)染試劑為脂質(zhì)體）（美國Invitrogen公司）；蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)（大連寶生物工程有限公司，范圍：6.5～200 kDa）mdr1單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；二氨基聯(lián)苯胺（DAB）檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；mdr1-ASODN、mdr1-SODN及引物（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）；MTT（美國Sigma公司）；ADM注射用粉末（美國法瑪西亞制藥公司，批號：20081103，規(guī)格：每瓶10 mg）；順鉑注射用粉末（DDP，美國施貴寶公司，批號：20081104，規(guī)格：每支20 mg）；5-氟尿嘧啶注射液（5-FU，江蘇同泰藥業(yè)有限公司，批號：20081105，規(guī)格：250 mg∶10 mL）。

ODN及引物序列見表1。

表1 ODN及引物序列Tab 1 Sequence of oligodeoxyribonucleotide and primer

1.3 細(xì)胞

人肝癌細(xì)胞HepG2由重慶醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室段紅教授惠贈；耐ADM肝癌細(xì)胞HepG2/ADM由重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院核醫(yī)學(xué)實驗室建立，方法如下：將ADM加入至HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液中，按培養(yǎng)瓶內(nèi)ADM終濃度逐次遞加0.1 mg·L－1，當(dāng)細(xì)胞存活率達(dá)到90%以上時，再進(jìn)行下一梯度的耐藥誘導(dǎo)，直至終濃度達(dá)到2 mg·L－1。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（含青霉素100 u·mL－1、鏈霉素100 u·mL－1），37 ℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng)HepG2/ADM細(xì)胞。取對數(shù)生長期HepG2/ADM細(xì)胞，以DMEM培養(yǎng)液稀釋制成2×105個/mL細(xì)胞懸液備用。

2.2 反義抑制試驗

2.2.1 分組。試驗分為mdr1-ASODN處理組、mdr1-SODN對照組和空白對照組。mdr1-ASODN處理組：HepG2/ADM細(xì)胞中加入mdr1-ASODN和脂質(zhì)體混合液；mdr1-SODN對照組：HepG2/ADM細(xì)胞中加入mdr1-SODN和脂質(zhì)體混合液；空白對照組：HepG2/ADM細(xì)胞中加入脂質(zhì)體。

2.2.2 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種HepG2/ADM細(xì)胞（濃度為2×105個/mL），加入無血清、無抗生素的DMEM培養(yǎng)液，大約24 h后，按照“2.2.1”項下分組加入ODN與脂質(zhì)體混合液（ODN與脂質(zhì)體質(zhì)量比為1∶3）200μL，繼續(xù)培養(yǎng)6 h。去除轉(zhuǎn)染液，每孔加DMEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清），繼續(xù)培養(yǎng)48 h。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染參照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行。

2.2.3 mdr1mRNA表達(dá)的檢測。采用RT-PCR法，提取各組細(xì)胞的總RNA，并用分光光度計定量，取3μg RNA在1.2%瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA的完整性。取5μg RNA為模板，用mdr1的特異引物，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR操作按試劑盒說明書進(jìn)行，同時以β-actin為內(nèi)參對照；并以水作為陰性對照檢測試驗過程是否有污染。取PCR擴增產(chǎn)物10μL在2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠（EB）染色，對PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行圖像照相及掃描分析，得β-actin及mdr1mRNA表達(dá)的灰度值，以mdr1mRNA灰度值/β-actin灰度值，表示mdr1mRNA表達(dá)相對含量，比較3組間mdr1mRNA表達(dá)的差異。

2.2.4 mdr1蛋白表達(dá)的檢測。采用蛋白免疫印跡法，分別提取各培養(yǎng)孔HepG2/ADM細(xì)胞的胞漿蛋白，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，將蛋白樣品轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，蛋白封閉液37℃封閉PVDF膜1 h，磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）洗滌，加mdr1單克隆抗體（1∶300）37 ℃孵育4 h，PBST振蕩洗滌2次，加過氧化物酶標(biāo)記二抗（1∶200）37℃孵育20 min，PBST洗滌4次，每次5 min，DAB室溫顯色，對顯色結(jié)果進(jìn)行照相及圖像掃描分析，得β-actin及mdr1蛋白表達(dá)的灰度值，以mdr1蛋白灰度值/β-actin灰度值，表示mdr1蛋白表達(dá)相對含量，比較3組間mdr1蛋白表達(dá)的差異。

2.3 MTT法檢測HepG2/ADM細(xì)胞對化療藥物的敏感性

HepG2/ADM細(xì)胞轉(zhuǎn)染mdr1-ASODN繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集對數(shù)生長期細(xì)胞作試驗組，未經(jīng)轉(zhuǎn)染處理的細(xì)胞作對照組，分別接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，每孔細(xì)胞數(shù)2×104個，每孔總體積200 μL。每個樣本設(shè)3個平行孔。2組細(xì)胞中分別加入培養(yǎng)液終濃度分別含20、10、50 mg·L－1的ADM、DDP和5-FU，37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加入0.5 mg·mL－1MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加入二甲基亞砜200 μL，振蕩5 min，酶標(biāo)儀（570 nm）檢測吸光度（A），計算平行孔平均A值，計算細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率＝（1－試驗組平均A值/對照組平均A值）×100%。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 HepG2/ADM細(xì)胞中mdr1mRNA表達(dá)比較

結(jié)果表明，本試驗過程沒有污染，空白對照組、mdr1-SODN對照組、mdr1-ASODN處理組mdr1mRNA表達(dá)相對含量分別為0.97±0.11、0.82±0.08、0.26±0.09。與mdr1-SODN對照組和空白對照組比較，mdr1-ASODN處理組HepG2/ADM細(xì)胞中mdr1mRNA表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。各組HepG2/ADM細(xì)胞中mdr1mRNA表達(dá)比較見圖1。

3.2 HepG2/ADM細(xì)胞中mdr1蛋白表達(dá)比較

圖1 各組HepG2/ADM細(xì)胞中mdr1mRNA表達(dá)比較Fig 1 Comparison of mdr1mRNA expression of HepG2/ADM in each group

結(jié)果表明，空白對照組、mdr1-SODN對照組、mdr1-ASODN處理組mdr1蛋白表達(dá)相對含量分別為0.66±0.07、0.62±0.08、0.34±0.07。與mdr1-SODN對照組和空白對照組比較，mdr1-ASODN處理組HepG2/ADM細(xì)胞中mdr1蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。各組HepG2/ADM細(xì)胞中mdr1蛋白表達(dá)比較見圖2。

圖2 各組HepG2/ADM細(xì)胞中mdr1蛋白表達(dá)比較Fig 2 Comparison of mdr1protein expression of HepG2/ADM in each group

3.3 HepG2/ADM細(xì)胞對化療藥物的敏感性

與對照組比較，ADM、DDP和5-FU對試驗組HepG2/ADM細(xì)胞增殖抑制率均明顯增加（P＜0.05），說明mdr1-ASODN轉(zhuǎn)染部分恢復(fù)了HepG2/ADM細(xì)胞對化療藥物的敏感性。2組HepG2/ADM細(xì)胞的增殖抑制率比較詳見表2。

表2 2組HepG2/ADM細(xì)胞的增殖抑制率比較（%%，±s，n＝3）Tab 2 Comparison of proliferation inhibition ratio of HepG2/ADM（%%，±s，n＝3）

表2 2組HepG2/ADM細(xì)胞的增殖抑制率比較（%%，±s，n＝3）Tab 2 Comparison of proliferation inhibition ratio of HepG2/ADM（%%，±s，n＝3）

組別對照組試驗組ADM 29.2±1.9 57.3±2.7 DDP 33.9±1.7 47.7±2.9 5-FU 31.6±1.6 52.2±2.3

4 討論

MDR是指一些腫瘤細(xì)胞對一種抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥性的同時對其他非同類藥物也產(chǎn)生耐藥性，這是造成腫瘤化學(xué)藥物治療失敗的主要原因。研究[3～6]發(fā)現(xiàn)，腫瘤MDR的產(chǎn)生與耐藥基因mdr1、mrp、lrp等表達(dá)上調(diào)有關(guān)，其中mdr1及其相應(yīng)編碼產(chǎn)物過度表達(dá)又是產(chǎn)生MDR的主要因素，故從基因水平抑制mdr1基因的表達(dá)來逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR的研究顯得十分必要。

反義技術(shù)[7，8]是應(yīng)用堿基配對的原理，以表達(dá)某種特定蛋白的基因為靶基因，人工設(shè)計一段與之互補的基因片段封閉該靶基因的表達(dá)，使之低表達(dá)或不表達(dá)，從而阻斷與此基因有關(guān)的一系列生物學(xué)行為。

本研究選擇肝癌細(xì)胞mdr1基因的關(guān)鍵區(qū)域作為靶基因，人為合成與之互補的脫氧核酸片段，在轉(zhuǎn)染ASODN后，檢測發(fā)現(xiàn)HepG2/ADM細(xì)胞中mdr1mRNA及其蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05），說明ASODN能夠進(jìn)入體外培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)與靶基因特異性結(jié)合，產(chǎn)生抑制靶基因表達(dá)的效果。

HepG2細(xì)胞屬人肝癌組織細(xì)胞，能大容量培養(yǎng)和傳代，是肝癌耐藥試驗研究的常用細(xì)胞株。腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性檢測常常采用MTT法[9，10]。MTT是一種簡便快捷的體外藥敏檢測法，人為誤差小。在MTT試驗中，筆者將經(jīng)過mdr1-ASODN轉(zhuǎn)染前、后的HepG2/ADM細(xì)胞分別用肝癌常用化療藥物ADM、DDP和5-FU處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞增殖抑制率較轉(zhuǎn)染前均有明顯提高，說明MDR肝癌細(xì)胞部分恢復(fù)了對化療藥物的敏感性。

本試驗表明，體外ASODN能有效抑制mdr1基因的表達(dá)，并恢復(fù)肝癌HepG2/ADM細(xì)胞對化療藥物的敏感性，是一種逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR的有效手段。但是ASODN應(yīng)用于體內(nèi)逆轉(zhuǎn)MDR，其自身的體內(nèi)穩(wěn)定性及對腫瘤細(xì)胞的靶向性作用將是今后研究的重點方向和難點問題。

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