HPLC 法測定復方銀連顆粒中綠原酸的含量

夏 蓮（廣西北海食品藥品檢驗所，北海市 536000）

復方銀連顆粒是由金銀花、連翹等多味中藥組成的臨床驗方，具有清熱、解毒、涼血的功效，臨床用于治療痤瘡效果良好。原方以煎劑入藥，筆者將其改成顆粒劑，既保持了煎劑吸收較快、作用迅速的優(yōu)點，又克服了煎劑需臨時煎煮、服用量大、攜帶儲存不方便、久置易發(fā)霉變質等缺點。本試驗采用高效液相色譜（HPLC）法，對復方銀連顆粒君藥金銀花中有效成分綠原酸的含量進行了測定，以為該制劑的質量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent1100型HPLC儀、8453紫外分光光度計（美國安捷倫公司）；LG16-W高速微量離心機（北京醫(yī)用離心機廠）；SHZ-DⅢ予華牌循環(huán)水真空泵（2 800 r·min-1，鞏義市英峪予華儀器廠）；BS224S電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；SB5200DT超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司，工作頻率：40 kHz，功率：200 W）。

綠原酸對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110715-200815）；乙腈（色譜純，天津市四有科技發(fā)展有限公司）；磷酸（分析純，中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司）；復方銀連顆粒（批號：100901、100903、100906）及其陰性對照顆粒（筆者自制）。

2 方法與結果

2.1 檢測波長的選擇

參照2010年版《中國藥典》（一部）“金銀花”項下綠原酸的測定條件[1]，并通過綠原酸對照品的紫外掃描結果，選擇327 nm為檢測波長。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Welchrom C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸（10∶90）；檢測波長：327 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30℃。分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液與陰性對照溶液各10 μL，注入液相色譜儀進行測定。結果表明，綠原酸峰與其他峰分離良好，陰性對照無干擾；理論板數(shù)按綠原酸峰計算應不低于3 000。色譜見圖1。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液 精密稱取綠原酸對照品適量，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含0.607 mg的對照品溶液。再精密量取0.5 mL，置2 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含151.75 μg的對照品溶液。再精密量取1 mL，置2 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含75.87 μg的對照品溶液，備用。

2.3.2 供試品溶液 取本品10 g，研細，取約1 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，加純凈水超聲溶解，冷卻至室溫后定容，搖勻，即得。

2.3.3 陰性對照溶液 按處方量稱取缺金銀花的其他藥材，制成缺綠原酸成分的陰性對照顆粒，并根據(jù)“2.3.2”項下方法制成陰性對照溶液。

2.4 線性關系考察

分別精密量取濃度為151.75 μg·mL-1的對照品溶液2、4、6、8、10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積積分值（Y）為縱坐標，進樣量（X，μg）為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程為Y＝2 970.3X+61.42（r＝0.999 6，n＝5）。結果表明，綠原酸進樣量在0.303 5～1.517 5 μg范圍內與峰面積積分值呈良好線性關系。

2.5 精密度試驗

精密量取濃度為75.87 μg·mL-1的對照品溶液10 μL，按上述色譜條件注入液相色譜儀，重復進樣5次，記錄峰面積。結果，平均峰面積為2 369.9，RSD＝1.72%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗

取復方銀連顆粒細粉（批號：100901）適量，共6份，分別按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定。結果，樣品中綠原酸的平均含量為1.520 mg·g-1，RSD＝2.37%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、12 h進樣10 μL，按上述色譜條件測定。結果，綠原酸峰面積的RSD＝1.15%（n＝5），表明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量的復方銀連顆粒細粉（批號：100901）6份，每份約0.5 g，精密稱定，分別精密加入濃度為0.607 mg·mL-1的綠原酸對照品溶液1.2 mL，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，計算加樣回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 1Results of recovery tests（n＝6）

2.9 樣品含量測定

分別取3批復方銀連顆粒各10 g，研細，取約1 g，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，并按上述色譜條件測定樣品中綠原酸的含量，結果見表2。

表2 樣品含量測定結果（n＝3）Tab 2Results of content determination of samples（n＝3）

3 討論

3.1 流動相的選擇

《中國藥典》和某些文獻采用不同比例的乙腈-0.4%磷酸溶液[1～5]作為流動相測定綠原酸的含量，但該流動相酸度較大，易損傷柱子，縮短柱子的壽命。因此，筆者通過參考文獻[6，7]，采用乙腈-0.1%磷酸溶液（10∶90）作為流動相。結果表明，綠原酸的峰分離效果與峰形的對稱性等方面與乙腈-0.4%磷酸溶液作流動相時比較無顯著差異，故選擇該系統(tǒng)作為流動相。

3.2 供試品溶液制備方法的選擇

筆者曾對比乙醇超聲提取法[5～10]和純凈水超聲提取法對供試品制備的影響，結果表明，采用乙醇超聲法制備供試品時，綠原酸的提取量僅約為純凈水超聲法提取量的69%；同時曾采用乙酸乙酯萃取法[11，12]對供試品進行純化，結果表明此法雖能除去部分雜質，但綠原酸損耗較高。綜合考慮，選擇純凈水超聲提取法作為供試品的制備方法。

綜上，本方法操作簡便、可靠，可用于復方銀連顆粒的質量控制。

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