不同采收期青翹和連翹葉中活性成分的含量比較Δ

張淑蓉，裴香萍，閆 艷，王晶晶（山西中醫(yī)學院，太原市 030024）

連翹為木犀科植物連翹Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl的干燥果實，秋季果實初熟尚帶綠色時采收，除去雜質，蒸熟，曬干，習稱“青翹”；果實熟透時采收，曬干，除去雜質，習稱“老翹”。連翹藥用歷史久遠，但多為野生，資源有限。為便于連翹資源的綜合開發(fā)利用，近年來研究人員對連翹不同部位的活性成分進行了比較研究[1～3]。在我國山西、陜西等地，將連翹葉作茶飲用已有較長歷史。現(xiàn)代藥理研究證實，連翹葉具有抗菌、保肝、抗氧化及抗衰老等作用[4～8]。本試驗參考相關文獻[9，10]，采用高效液相色譜（HPLC）法，使用同一色譜系統(tǒng)同時測定不同采收期青翹和連翹葉中連翹酯苷、蘆丁和連翹苷的含量，并比較青翹和連翹葉中活性成分的含量變化，以確定青翹和連翹葉的最佳采收期。

1 儀器與試藥

HPLC儀，包括Waters2695二元液相色譜泵、Waters2998光電二極管陣列檢測器（美國Waters公司）；FA/JA1004型萬分之一天平（上海精密科學儀器有限公司）；KQ5200V型超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）。

試驗用水為雙蒸水，甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純；連翹苷（批號：110821-200610）、蘆丁（批號：100080-200707）對照品均購自中國藥品生物制品檢定所（供含量測定用）；連翹酯苷標準品（遼寧省生物醫(yī)藥研究所，純度＞98.0%）；青翹和連翹葉于2008年6月－10月采自山西太原，由山西中醫(yī)學院中藥鑒定教研室牛燕珍講師鑒定分別為連翹F.suspense（Thunb.）Vahl的果實和葉。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Alltima C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脫（0～8 min，30%～33%A；8～24 min，33%～40%A；24～39 min，40%～48%A；39～55 min，48%～64%A；55～65 min，64%～30%A；65～75 min，30%A）；檢測波長：280 nm；流速：0.8 mL·min-1；柱溫：室溫。在此色譜條件下，對照品和供試品溶液中各色譜峰的分離度良好，其他成分對連翹酯苷、蘆丁和連翹苷的含量測定無干擾。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.2 混合對照品溶液的制備

精密稱取連翹酯苷標準品與蘆丁、連翹苷對照品各適量，置同一5 mL量瓶中，加甲醇制成濃度分別為1.480、0.326、0.586 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

將不同采收期的青翹蒸制30 min、60℃烘干；連翹葉自然晾干，研細。精密稱取0.5 g，置50 mL具塞三角瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，稱重，超聲提?。üβ剩?50 W，頻率：40 kHz）30 min，放冷，再稱重，用50%甲醇補足失重，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 線性關系考察

精密吸取混合對照品溶液0.1、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，分別置2 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得系列濃度的對照品溶液。分別精密吸取10 μL注入液相色譜儀，測定峰面積積分值。以進樣量（X，μg）為橫坐標，峰面積積分值（Y）為縱坐標，制備標準曲線，得連翹酯苷的回歸方程為Y＝1 005 505.0X－4 593.6（r＝0.999 9，n＝6），線性范圍為0.74～14.80 μg；蘆丁的回歸方程為Y＝879 780.0X+2 959.1（r＝0.999 7，n＝6），線性范圍為0.163～3.260 μg；連翹苷的回歸方程為Y＝761 687.0X+38 560.6（r＝0.999 8，n＝6），線性范圍為0.293～5.860 μg。

2.5 精密度試驗

精密吸取連翹酯苷（0.74 mg·mL-1）、蘆?。?.163 mg·mL-1）、連翹苷（0.293 mg·mL-1）混合對照品溶液 10 μL，重復進樣6次，測定峰面積。結果，連翹酯苷、蘆丁、連翹苷峰面積的RSD分別為1.13%、1.07%、0.91%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一供試品溶液10 μL，于0、3、6、9、12 h分別進樣測定，記錄峰面積。結果，連翹酯苷、蘆丁、連翹苷峰面積的RSD分別為0.99%、1.44%、1.25%（n＝5），表明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定。

2.7 重復性試驗

精密稱取同一樣品（于2008-07-31采收的連翹葉）粉末0.5 g，共6份，分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，照“2.1”項下色譜條件分析測定。結果，連翹酯苷、蘆丁和連翹苷的平均含量分別為4.00%、0.91%、1.32%，RSD分別為1.95%、2.45%、2.42%（n＝6），表明該方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的同一樣品（于2008-07-31采收的連翹葉）粉末0.25 g，共6份，分別精密加入連翹酯苷、蘆丁、連翹苷混合對照品溶液（濃度分別為1.92、0.42、0.64 mg·mL-1）5 mL，照“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，計算加樣回收率，結果見表1。

2.9 樣品含量測定

取不同采收期的樣品粉末，分別精密稱取0.5 g，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，照“2.1”項下色譜條件測定樣品中3種成分的含量，結果見表2（表中“-”表示10月中旬已采收不到青翹）。青翹和連翹葉中測定成分隨采收日期的變化趨勢見圖2。

3 討論

本試驗結果顯示，連翹酯苷的含量青翹高于同期連翹葉，蘆丁和連翹苷的含量則是連翹葉高于同期青翹。連翹葉能否代替青翹使用及兩者的藥效作用比較有待進一步研究。青翹中連翹酯苷、蘆丁和連翹苷3種成分均是7月上旬含量最高，以后逐漸降低，故青翹以7月份采收為宜；連翹葉中連翹酯苷和連翹苷含量在6月最高，以后逐漸降低，9月下旬有所回升，之后又降低；蘆丁則是7月含量最高，之后變化趨勢同連翹酯苷和連翹苷，因此連翹葉以6～7月采收為宜。6～7月份葉子處于生長旺盛時期，此正符合葉類藥材的一般采收規(guī)律。為避免較早采收葉子可能對果實造成的不利影響，建議在采收連翹果之后再采收連翹葉；另外，亦可以在9月下旬活性成分回升時采收連翹葉，以充分利用資源。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 1Results of recovery tests（n＝6）

表2 樣品含量測定結果（%）Tab 2Results of content determination of samples（%）

圖2 青翹和連翹葉中測定成分隨采收日期的變化圖Fig 2 Tendency chart of determination composition in fruit and folium of F.suspensa with harvesting time

目前有關連翹的制劑多以連翹苷作為質控指標；而研究表明連翹酯苷是連翹具有抗病毒、抗氧化作用的重要活性組分之一[11]，且是連翹活性成分中含量最高的；蘆丁具有抗氧化、降低毛細血管脆性與通透性等多種活性[12]。因此，選擇上述3種物質作為指標成分，可以較為全面地反映連翹質量。

本試驗參考相關文獻[9，10]，建立了同一色譜系統(tǒng)同時測定連翹中連翹酯苷、蘆丁和連翹苷含量的HPLC法，該方法簡便、快速、準確，可為確定連翹果和葉的合適采收期提供理論依據(jù)，同時為擴大連翹葉資源的開發(fā)和臨床應用提供有意義的參考。

[1] 周改蓮，辛 寧，張守平，等.連翹不同部位及不同炮制方法的活性成分比較[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2008，15（增刊）：30.

[2] 曲歡歡，翟西峰，李白雪，等.連翹不同部位中連翹酯苷和連翹苷的含量分析[J].藥物分析雜志，2008，28（3）：382.

[3] 李發(fā)榮，段 飛，楊建雄.中藥連翹及連翹葉中連翹苷含量的比較研究[J].西北植物學報，2004，24（4）：725.

[4] 薛愧玲，袁王俊.連翹葉的藥理研究綜述[J].時珍國醫(yī)國藥，2009，20（5）：1 149.

[5] 楊建雄，劉 靜，李發(fā)榮，等.連翹葉茶抗氧化抗衰老作用的實驗研究[J].營養(yǎng)學報，2004，26（1）：65.

[6] 段 飛，張雙民，楊建雄，等.連翹葉提取物抑菌作用的研究[J].西北藥學雜志，2005，20（2）：66.

[7] 黃亞亞，楊建雄，趙詠梅.連翹葉黃酮對力竭游泳恢復小鼠的抗疲勞作用研究[J].天然產物研究與開發(fā)，2009，21（6）：1 019.

[8] 孟祥樂，李俊平，李 丹，等.連翹的化學成分及其藥理活性研究進展[J].中國藥房，2010，21（43）：4 117.

[9] 楊建雄，柴渭莉，邱 娟.連翹葉中苷類成分的分離與HPLC鑒定[J].中成藥，2007，29（7）：1 086.

[10] 張 杲，李發(fā)榮，段 飛，等.不同采收期連翹葉中連翹苷、連翹酯苷和蘆丁的含量測定[J].天然產物研究與開發(fā)，2005，17（6）：790.

[11] 張 煒，張漢明，郭美麗.連翹的藥理學研究[J].中國現(xiàn)代應用藥學雜志，2000，17（1）：7.

[12] 韓英華，秦元璋.蘆丁研究現(xiàn)狀[J].山東中醫(yī)雜志，2003，22（10）：635.