痛風(fēng)顆粒HPLC指紋圖譜研究Δ

徐玲玲，徐 熠，年 華（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科，上海市 200437）

痛風(fēng)顆粒由茵陳、連錢草、伸筋草等藥物組成，具有清熱、利濕、通絡(luò)的作用，常用于治療慢性痛風(fēng)、關(guān)節(jié)炎等癥，臨床療效顯著。方中以茵陳作為君藥，取其清利濕熱、芳香舒脾、透表暢氣之效；以連錢草作為臣藥，取其消石之功，防止痛風(fēng)性尿路結(jié)石的產(chǎn)生，配伍茵陳可以增強(qiáng)其利濕通絡(luò)的作用；加之伸筋草祛風(fēng)除濕、舒筋活血，達(dá)到通絡(luò)的作用。該方中主要含有綠原酸[1]、黃酮[2]、石松堿[3]等多種化學(xué)成分，多靶點(diǎn)地對(duì)慢性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎起到治療效果[4]。目前，單對(duì)一種成分進(jìn)行質(zhì)量控制已經(jīng)達(dá)不到有效控制和評(píng)價(jià)中藥復(fù)方制劑的目的。因此，本試驗(yàn)對(duì)痛風(fēng)顆粒進(jìn)行高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜研究，以期為痛風(fēng)顆粒的質(zhì)量控制研究提供思路。

1 儀器與試藥

1200型HPLC儀（美國(guó)Agilent公司）；BS124S電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；B5200S-DT超聲提取器（必能信超聲（上海）有限公司）。

綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：0753-200111）、伸筋草（批號(hào)：121109-200401）、茵陳（批號(hào)：950-200204）均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；連錢草（上海同濟(jì)堂藥業(yè)有限公司，批號(hào)：090801，經(jīng)上海中藥質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)室葉愈青副主任藥師鑒定為真品）；甲醇（色譜純，批號(hào)：Lot.096964）、乙腈（色譜純，批號(hào)：Lot.100751）均購(gòu)自美國(guó)Fisher Scientific公司；異丙醇（分析純，美國(guó)TEDIA公司，批號(hào)：Lot.909904）；磷酸為分析純，水為雙蒸水；痛風(fēng)顆粒（上海上聯(lián)藥業(yè)有限公司，批號(hào)：081001、090501、090502、090701、090722、090901、091001、091101、100101、100401）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.05%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0 min，4%B；20 min，80%B；40 min，32%B；50 min，36%B；50～55 min，4%B）；柱溫：20 ℃；流速：1 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：327 nm。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取綠原酸對(duì)照品適量，用甲醇溶解稀釋成64 μg·mL-1的對(duì)照品溶液，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，備用。

2.3 供試品溶液的制備

取痛風(fēng)顆粒2.5 g，精密稱定，研細(xì)，置于具塞錐形瓶中，加50%甲醇超聲（工作頻率：42 kHz，功率：260 W）30 mim，過(guò)濾，取續(xù)濾液5 mL，置10 mL容量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，備用。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 圖譜測(cè)定時(shí)間的確定 取供試品溶液進(jìn)樣10 μL，按上述色譜條件進(jìn)行梯度洗脫，記錄120 min。結(jié)果，40 min后無(wú)有意義峰出現(xiàn)，故圖譜測(cè)定時(shí)間確定為55 min。

2.4.2 參照物的確定 痛風(fēng)顆粒的處方藥材含有機(jī)酸、黃酮、生物堿等多種有效成分。通過(guò)對(duì)供試品和對(duì)照品的圖譜比較（見(jiàn)圖1），綜合考慮出峰面積、出峰時(shí)間及分離度等因素，發(fā)現(xiàn)綠原酸在制劑中的含量最高、色譜峰分離度較好且純度較高，因此采用綠原酸作為參照物。

圖1 供試品溶液和綠原酸對(duì)照品溶液的HPLC對(duì)照?qǐng)D譜Fig 1 HPLC chromatograms of test sample and chlorogenic acid control

2.4.3 精密度試驗(yàn) 精密稱取痛風(fēng)顆粒（批號(hào)：090722）2.5 g，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄指紋圖譜并分析。結(jié)果，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.00%～0.20%，相對(duì)峰面積的RSD為0.00%～2.89%，相似度為0.999～1，表明本方法精密度良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取痛風(fēng)顆粒（批號(hào)：090722）適量，共6份，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣，記錄并分析。結(jié)果，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.00%～0.09%，相對(duì)峰面積的RSD除4、14～17號(hào)峰外，均＜3%，相似度為0.999～1，表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取痛風(fēng)顆粒（批號(hào)：090722）適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、24 h進(jìn)樣，記錄并分析。結(jié)果，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.00%～0.47%，相對(duì)峰面積的RSD除10～11、13、16、19～21號(hào)峰外，均＜3%，相似度為0.998～1，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 樣品指紋圖譜測(cè)定

取10批痛風(fēng)顆粒各適量，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣，記錄，比較色譜圖（見(jiàn)圖2、圖3），確定共有峰為21個(gè)。

圖2 痛風(fēng)顆粒的HPLC圖Fig 2 HPLC chromatograms of Tongfeng granules

圖3 10批痛風(fēng)顆粒的HPLC指紋圖譜Fig 3 HPLC fingerprints of 10 batches of Tongfeng granules

2.6 相似度計(jì)算

采用國(guó)家藥典委員會(huì)頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004 A版）》軟件對(duì)10批樣品進(jìn)行相似度分析。以S1為參照得出對(duì)照指紋圖譜，以此為基礎(chǔ)進(jìn)行整體相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果，相似度評(píng)價(jià)結(jié)果均＞0.9（見(jiàn)表1），表明10批樣品中的化學(xué)成分較一致。

2.7 指紋圖譜共有峰的歸屬

按痛風(fēng)顆粒制備工藝，分別制備茵陳、連錢草和伸筋草藥材的供試品溶液，按已建立的指紋圖譜色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，與痛風(fēng)顆粒的全圖譜進(jìn)行比較。結(jié)果表明，在痛風(fēng)顆粒指紋圖譜21個(gè)峰中，有16個(gè)峰歸屬茵陳（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、18、19、20），其中4、11號(hào)峰為茵陳特征峰；11個(gè)峰歸屬連錢草（1、2、3、7、8、10、13、14、15、20、21），其中14、15、21號(hào)峰為連錢草的特征峰；11個(gè)峰歸屬伸筋草（1、2、5、6、7、9、10、12、13、16、17），其中16、17號(hào)峰為伸筋草的特征峰。

表1 痛風(fēng)顆粒的指紋圖譜相似度Tab 1 Similarity degree of the fingerprints of Tongfeng granules

3 討論

3.1 色譜柱的確定

由于不同型號(hào)和不同廠家的色譜柱存在填料及性能上的差異，會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果，因此對(duì)J’sphere ODS-H80（150 mm×4.6 mm，5 μm，日本YMC公司）、ZORBAX Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm，美國(guó)安捷倫公司）和ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm，美國(guó)安捷倫公司）3種色譜柱進(jìn)行比較。結(jié)果表明，J’sphere ODS-H80和ZORBAX SB-C18的出峰效果優(yōu)于ZORBAX Eclipse XDB-C18，且所出峰較多；而ZORBAX SB-C18各峰的分離度優(yōu)于J’sphere ODS-H80，因此采用ZORBAX SB-C18作為試驗(yàn)用色譜柱。

3.2 流動(dòng)相的確定

本試驗(yàn)考察了甲醇-0.05%磷酸水溶液、乙腈-0.05%磷酸水溶液、乙腈-水、甲醇-1%醋酸水溶液、乙腈-1%醋酸水溶液作為流動(dòng)相的分離效果。結(jié)果，由于乙腈-0.05%磷酸水溶液的分離度較佳，故最后選其作為試驗(yàn)用流動(dòng)相。

3.3 柱溫的確定

分別在20、30、40℃的柱溫條件下對(duì)樣品的分離效果進(jìn)行考察。結(jié)果表明，隨著柱溫的升高，各色譜峰的出峰時(shí)間明顯提前。在30與40℃柱溫條件下，17～25 min區(qū)間的幾組峰的分離效果較20℃柱溫條件下更差，故采用20℃柱溫作為試驗(yàn)條件。

3.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

試驗(yàn)考察了327、254、280 nm波長(zhǎng)條件下可獲取的色譜圖。結(jié)果表明，痛風(fēng)顆粒中的成分在327 nm波長(zhǎng)條件下有較好的響應(yīng)。比較各個(gè)峰的吸收波長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)均在320～330 nm區(qū)間有最佳吸收，因此選用327 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.5 提取溶劑的考察

分別采用70%乙醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇作為提取溶劑，進(jìn)行色譜圖比較。結(jié)果表明，70%乙醇與70%甲醇比較，70%甲醇的提取成分較多，提取率較高，因此采用甲醇作為提取溶劑；再比較70%、50%、30%甲醇提取的圖譜，發(fā)現(xiàn)50%和30%甲醇的提取效果明顯優(yōu)于70%甲醇的提取效果，而50%甲醇提取效果要略高于30%甲醇，因此采用50%甲醇作為提取溶劑。

3.6 方法評(píng)價(jià)

本試驗(yàn)以綠原酸作為參照物，對(duì)痛風(fēng)顆粒進(jìn)行HPLC指紋圖譜研究，可以完整、全面地反映痛風(fēng)顆粒的質(zhì)量。本研究所建立的方法可以有效、快速地對(duì)痛風(fēng)顆粒的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，并為該制劑的質(zhì)量控制提供借鑒。

[1] 江 濱，王風(fēng)云，曾元兒.綿茵陳藥材提取液中綠原酸穩(wěn)定性影響因素考察[J].中成藥，2007，29（3）：359.

[2] 李志平，尹篤林，李佑稷，等.超聲波和微波輔助法提取茵陳總黃酮的條件研究[J].湖南城市學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，16（3）：56.

[3] 譚昌恒，朱大元.石松生物堿研究進(jìn)展[J].中國(guó)天然藥物，2003，1（1）：9.

[4] 徐 熠，徐玲玲.中醫(yī)藥治療痛風(fēng)的研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥房，2010，21（23）：2 195.