兔脂肪干細胞體外成骨誘導培養(yǎng)及成骨活性鑒定的實驗研究

張開剛，張月東，王 玫

脂肪干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種成體干細胞，2001年Zuk等[1]首次從人的脂肪組織懸液中分離出類似于骨髓間充質(zhì)干細胞，可以在體外穩(wěn)定增殖，具有多向分化潛能的脂肪干細胞。因具有來源豐富、取材方便、對機體的損傷小、增殖快、能多向分化等優(yōu)點，迅速成為組織工程學、再生醫(yī)學等領(lǐng)域的研究熱點。本實驗通過分離培養(yǎng)兔脂肪干細胞，研究其成骨分化能力，探討其作為骨組織工程種子細胞的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器 Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶、地塞米松、維生素C、β-甘油磷酸鈉（sigma公司，美國）；高糖DMEM（Gibco公司，美國）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染 色 試 劑 盒 、EDTA、四環(huán)素（華美生物工程公司）；茜素紅（Amersco公司，美國）；恒溫CO2培養(yǎng)箱（Queue Systems公司，美國）；病理切片機（leica公司，德國）。

1.1.2 實驗動物 4月齡體重為2.0～2.5 kg的健康新西蘭大白兔，雌雄不拘，泰山醫(yī)學院實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（魯）2005-0005。

1.2 方法

1.2.1 ADSCs的分離、培養(yǎng)及傳代 4月齡健康新西蘭大白兔，經(jīng)耳緣靜脈注射空氣栓塞致死，取兔雙側(cè)腹股溝脂肪，PBS液沖洗剪碎，Ⅰ型膠原酶法消化，加入高糖DMEM培養(yǎng)液重懸浮，恒溫CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隔日換液，融合達90%～95%后傾倒原培養(yǎng)液，PBS液輕緩漂洗貼壁細胞2次，盡量洗去殘余血清，棄PBS液。在培養(yǎng)瓶中加入適量消化液（0.20%胰蛋白酶+0.02%EDTA）消化，吸管吸取培養(yǎng)液，反復輕柔吹打培養(yǎng)瓶底壁，使已消化的細胞脫離瓶壁，吹打液1200 r/min離心10 min，棄上清。用培養(yǎng)液將沉積細胞重新懸浮，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，傳代比例為1∶2，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)特征及傳代情況。

1.2.2 ADSCs的成骨誘導培養(yǎng) 成骨誘導培養(yǎng)液的配制按文獻[2]所述：DMEM培養(yǎng)液+10%胎牛血清+0.l μmo1/L地塞米松+50 mg/L維生素C+10 mmol/L β-甘油磷酸鈉+1%雙抗（青霉素、鏈霉素）；普通培養(yǎng)液的配制：高糖DMEM培養(yǎng)液+10%胎牛血清+1%雙抗（青霉素、鏈霉素）

取第3代ADSCs，以l×105/cm密度接種于24塊蓋玻片，置于37℃、體積分數(shù)為5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細胞長滿后隨機分為2組，其中12片作為成骨誘導組，加入成骨誘導液復合培養(yǎng)，進行成骨誘導分化；其余12塊作為對照組，加入普通培養(yǎng)液培養(yǎng)。共培養(yǎng)4周，每72 h換液1次。

1.2.3 ADSCs的鑒定 以下3種染色實驗均重復進行3次。

ALP染色：第3代細胞成骨誘導1周后取出蓋玻片，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌3次，滴加ALP染色液，蒸餾水反復沖洗3次，晾干后甘油明膠封片、鏡檢。

茜素紅染色：第3代細胞成骨誘導4周后取出蓋玻片，洗滌3次，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌3次，加入1%茜素紅溶液（pH 8.3，Tris-HCl配制），37℃染色30 min，蒸餾水反復沖洗3次，晾干后甘油明膠封片、鏡檢。

Von Kossa（鈣結(jié)節(jié)）染色：第3代細胞成骨誘導4周后取出蓋玻片，洗滌3次，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌3次，加入5%硝酸銀溶液，避光孵育30 min，紫外線燈下染色1 h，蒸餾水沖洗3次，加入5%硫代硫酸鈉作用5 min，蒸餾水沖洗3次，1%中性紅復染5 min，蒸餾水反復沖洗3次，晾干后甘油明膠封片、鏡檢。

2 結(jié)果

2.1 ADSCs體外培養(yǎng)的生物學特性

原代ADSCs 8 h開始貼壁，24 h完成貼壁，接種后可見部分懸浮呈圓形的血細胞混雜其中，輪廓清晰，細胞呈短梭形和多角形（圖l），5～7 d融合達90%～95%，大約兩周內(nèi)傳至第3代，細胞數(shù)量擴增200～300倍，絕大多數(shù)細胞呈扁平的長梭形，局部排列有一定方向性，呈魚群狀（圖2）。

2.2 ADSCs體外成骨誘導及鑒定

2.2.1 ALP染色 培養(yǎng)第3代的ADSCs細胞成骨誘導1周之后進行ALP染色，胞漿內(nèi)可見藍色顆粒（圖3），而對照組ALP染色呈陰性（圖4）。

2.2.2 茜素紅染色 培養(yǎng)第3代的ADSCs細胞成骨誘導4周之后進行茜素紅染色，細胞結(jié)節(jié)中央染色為紅色團塊，細胞結(jié)構(gòu)為紫紅色（圖5），對組照僅見紫色細胞結(jié)構(gòu)，結(jié)節(jié)中央未見紅色團塊染色（圖6）。

圖1 原代ADSCs呈短梭形（×100）

圖2 第3代ADSCs呈扁平長梭形，形成魚群狀（×100）

圖3 ALP檢測胞漿內(nèi)可見藍色顆粒（ALP染色，×200）

圖4 對照組ALP染色陰性（ALP染色，×200）

2.2.3 Von Kossa染色 培養(yǎng)第3代的ADSCs細胞成骨誘導4周后行Von Kossa染色，細胞集落中央?yún)^(qū)形成明顯的鈣化結(jié)節(jié)，細胞結(jié)節(jié)中央為黑色團塊（圖7），對照組則無黑色團塊形成（圖8）。

3 討論

干細胞是一種具有多向分化潛能和自我復制能力的原始未分化細胞，是構(gòu)建組織工程骨重要的種子細胞來源。根據(jù)來源不同，干細胞可分為胚胎干細胞（embryonic stem cell，ESC）和成體干細胞（adult stem cell，ASC）。ASC存在于人體各種組織中，具有自我更新和分化成多種組織（骨、軟骨、脂肪、神經(jīng)）的能力，正常生理情況下干細胞多處于G0期或緩慢向G1期轉(zhuǎn)化[3]。在研究領(lǐng)域，許多人和動物不同部位來源的ASC已得到分離和鑒定[4-6]。脂肪干細胞（ADSCs）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種成體干細胞，與骨髓間充質(zhì)干細胞類似，有多向分化潛能，可以在體外穩(wěn)定增殖。因其具有安全性高[7]、獲得率高等優(yōu)點，故迅速成為目前組織工程學的研究熱點。有文獻指出，ADSCs接種12～24 h后細胞可達到完全貼壁，傳代培養(yǎng)后增殖迅速，能穩(wěn)定傳代10代左右，故此可為組織修復提供充足的種子細胞[8-9]。亦有研究證實，ADSCs成骨培養(yǎng)后，細胞外基質(zhì)中出現(xiàn)Ⅰ型膠原蛋白、BMP-2、BMP受體等[10-11]成骨基因表達產(chǎn)物。本實驗對兔皮下脂肪進行分離培養(yǎng)，結(jié)果顯示，兔ADSCs貼壁迅速，細胞呈短梭形和多角形，傳代后細胞增殖迅速，具有成骨分化潛能。

研究顯示，ADSCs的體外分離及培養(yǎng)所應(yīng)用的消化酶、消化方法并不完全相同[12-13]，由于成熟脂肪基質(zhì)中含有大量Ⅰ型膠原，因此本實驗采用Ⅰ型膠原酶消化法分離ADSCs，用培養(yǎng)基重懸細胞后接種到培養(yǎng)瓶中，通過細胞貼壁獲得ADSCs。

關(guān)于ADSCs的鑒定，目前尚未發(fā)現(xiàn)特異性表面分子標志物。本實驗通過觀察細胞的形態(tài)并繪制生長曲線，發(fā)現(xiàn)此細胞具有穩(wěn)定、迅速的增殖能力，符合干細胞的生物學特點；而在脂肪干細胞分離、純化過程中的一些混雜細胞如紅細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞等，盡管很難一次性徹底清除，但數(shù)量很少，約占細胞群的5%～20%，這些細胞大部分不能貼壁生長，增殖能力有限，隨傳代培養(yǎng)其數(shù)量逐漸減少。需要強調(diào)的是，在ADSCs運用過程中，選擇合適時機、提高純度是首要問題。本實驗選擇在倒置相差顯微鏡下觀察判斷：一般以細胞突起回縮、細胞間隙增大、細胞近乎縮成圓形為度，此時應(yīng)立即吸出消化液，加入含有血清的培養(yǎng)液，終止消化，以保證消化的純度。

本研究通過反復3次試驗證實，第3代ADSCs在成骨誘導培養(yǎng)下，1周時通過ALP染色檢測，胞漿內(nèi)可見藍色顆粒，表明細胞在誘導1周時已具有成熟成骨細胞的特點；4周時茜素紅染色檢測，細胞結(jié)節(jié)中央染色為紅色團塊，細胞結(jié)構(gòu)為紫紅色，顯示細胞已形成鈣鹽沉積，進入礦化期；4周時鈣結(jié)節(jié)染色檢測，細胞集落中央?yún)^(qū)形成明顯的鈣化結(jié)節(jié)，大量鈣鹽沉積，表明細胞進入基質(zhì)礦化期。而對照組培養(yǎng)的細胞均無相應(yīng)變化。

本實驗雖在體外提取出兔脂肪干細胞并進行成骨誘導培養(yǎng)，但對于脂肪干細胞的鑒定未進行更明確的指標測定。下一步研究希望能夠利用脂肪干細胞與支架材料復合，構(gòu)建新型仿生性材料，并進一步開展其在修復骨質(zhì)缺損方面的動物實驗研究。

圖5 細胞結(jié)節(jié)中央為紅色團塊（茜素紅染色，×40）

圖6 對照組細胞結(jié)節(jié)中央未見紅色團塊（茜素紅染色，×40）

圖7 細胞結(jié)節(jié)中央為黑色團塊（Von Kossa染色，×40）

圖8 對照組細胞結(jié)節(jié)中央無黑色團塊（Von Kossa染色，×40）

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