頸椎終板軟骨細(xì)胞凋亡的檢測及相關(guān)意義

王 鑫，陳貴月，崔海文，崔樹科，樊永勝，趙先進(jìn)，姚衛(wèi)紅，高旭紅，郭侃凱

頸椎間盤退變是頸椎病發(fā)生發(fā)展的病理基礎(chǔ)，但具體的退變機(jī)制目前尚不明確。終板作為椎間盤的組成部分之一，在髓核營養(yǎng)交換和椎間盤應(yīng)力保護(hù)方面起重要作用。近年來研究證實(shí)，退變終板中存在較高的細(xì)胞凋亡率[1-2]，但細(xì)胞凋亡在椎間盤退變中的作用有待進(jìn)一步深入研究。本研究采用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記（terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP nick end labeling，TUNEL）法和咔唑分光光度法分別檢測退變及外傷頸椎終板軟骨細(xì)胞的細(xì)胞凋亡指數(shù)和髓核蛋白多糖含量，分析其相關(guān)關(guān)系，進(jìn)而探討頸椎終板軟骨細(xì)胞凋亡在椎間盤退變中的作用。

1 材料與方法

1.1 頸椎間盤組織的選擇及處理

1.1.1 病例納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 退變組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）MRI顯示相應(yīng)節(jié)段髓核信號(hào)異常；（2）影像學(xué)顯示有明確的間盤突出；（3）術(shù)后病理檢查[3]示相應(yīng)椎間盤已發(fā)生明顯退變。剔除標(biāo)準(zhǔn)：排除外傷性頸脊髓損傷患者。外傷組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）明確的頸椎外傷史；（2）影像學(xué)檢查可見頸椎骨折、脫位、頸脊髓信號(hào)改變。剔除標(biāo)準(zhǔn)：（1）MRI顯示病變節(jié)段相鄰椎間盤信號(hào)異常者，推斷該節(jié)段間盤已經(jīng)發(fā)生退變；（2）術(shù)后病理檢查示椎間盤已發(fā)生明顯退行性改變者。

1.1.2 一般資料 我院骨科2009年1月至2010年6月行頸椎前路手術(shù)的患者中符合納入標(biāo)準(zhǔn)者共54例，獲取頸椎間盤組織標(biāo)本61份。其中退變組標(biāo)本取自手術(shù)治療的35例脊髓型頸椎病患者，男25例，女10例，平均年齡52.2歲。病變節(jié)段：C3～C47例 ，C4～C512例，C5～C617例，C6～C73例，單節(jié)段病例31例，雙節(jié)段病例4例。行單節(jié)段間盤切除前路融合固定術(shù)29例，單節(jié)段間盤切除、人工椎間盤置換術(shù)2例，雙節(jié)段間盤切除前路融合術(shù)4例。外傷組標(biāo)本取自手術(shù)治療的19例頸椎創(chuàng)傷患者，均為男性，平均年齡38.8歲。病變節(jié)段：C2～C31例，C3～C44例，C4～C57例，C5～C66例，C6～C74例，單節(jié)段病例16例，雙節(jié)段病例3例。行單節(jié)段間盤切除前路融合16例，椎體次全切除3例。

1.1.3 標(biāo)本的處理 術(shù)中所取標(biāo)本為終板軟骨及髓核組織，生理鹽水沖洗后分送檢驗(yàn)科及病理科保存待檢。

1.2 主要試劑和儀器

細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒、脫氧核糖核酸酶(南京凱基生物科技有限公司)，木瓜蛋白酶、D-葡萄糖醛酸、咔唑(中國醫(yī)化集團(tuán)上海分公司)，恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療設(shè)備廠），光學(xué)顯微鏡（Olympus公司，日本），CO2恒溫培養(yǎng)箱（Thermo公司，美國），組織切片機(jī)（Leica公司，德國），病理圖文分析系統(tǒng)（濟(jì)南丹吉爾電子有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 終板軟骨及髓核細(xì)胞的光鏡觀察 組織切片常規(guī)脫蠟，梯度乙醇逐級(jí)水化，蘇木素染色后自來水沖洗，伊紅復(fù)染，梯度乙醇逐級(jí)脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察兩組頸椎終板軟骨及髓核的細(xì)胞形態(tài)、分布及數(shù)量，計(jì)算細(xì)胞密度：100倍鏡下隨機(jī)觀察計(jì)數(shù)5個(gè)視野，記錄各樣本終板及髓核細(xì)胞數(shù)，取其平均值為細(xì)胞密度。

1.3.2 TUNEL法檢測終板及髓核細(xì)胞的細(xì)胞凋亡指數(shù) 實(shí)驗(yàn)步驟：（1）石蠟切片常規(guī)脫蠟，梯度乙醇脫水；（2）將切片浸入濃度為0.01 mol/L的枸椽酸鹽緩沖液（pH=6.0）中，并置于醫(yī)用高壓鍋內(nèi)，沸煮2.5 min，室溫冷卻，PBS漂洗3次；（3）蛋白酶K 37℃消化30 min；（4）過氧化氫甲醇30 μL/片，室溫封閉10 min；（5）滴加TdT酶反應(yīng)液30 μL/片，37℃避光濕潤反應(yīng) 60 min，PBS 漂洗 3次；（6）滴加Streptavidin-HRP工作液，4℃避光濕潤反應(yīng)過夜，PBS漂洗3次；（7）滴加新鮮配制的DAB工作液，低倍光鏡下控制顯色時(shí)間，顯色適度后流水沖洗終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染，自來水沖洗返藍(lán)，梯度乙醇逐級(jí)脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

陽性對(duì)照組在步驟4后用DNase（1 mg/mL）消化10 min后加入TUNEL反應(yīng)混合液；陰性對(duì)照組不加TdT酶反應(yīng)液。以細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽性凋亡細(xì)胞。隨后分別計(jì)算兩組的細(xì)胞凋亡指數(shù)：100倍光鏡下隨機(jī)觀察計(jì)數(shù)5個(gè)視野，記錄陽性及陰性凋亡細(xì)胞數(shù)，以陽性凋亡細(xì)胞數(shù)除以細(xì)胞總數(shù)所得數(shù)值為凋亡指數(shù)。

1.3.3 咔唑比色法檢測髓核蛋白多糖含量 實(shí)驗(yàn)步驟：（1）髓核切片，置于20 mL試管中，加丙酮2次，各于6 h后棄去丙酮，乙醚37℃脫脂24 h；（2）蒸餾水沖洗3次，烘箱50℃，恒溫4 h；（3）電子天平精確稱量標(biāo)本10 mg，置于試管中，加入木瓜酶消化液0.5 mL，60℃消化7 h（每2 h攪拌1次）；（4）冷卻至室溫后加入濃度為20%的三氯醋酸0.5 mL，室溫放置2 h；（5）離心（3500轉(zhuǎn)/分）5 min，取上清液50 μL，加入蒸餾水5000 μL，取500 μL，冰水浴中加濃硫酸3000 μL，震蕩后100℃水浴20 min，加100 μL咔唑，測530 nm吸光值（OD值）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。對(duì)兩組之間頸椎終板及髓核的細(xì)胞密度、凋亡指數(shù)以及OD值比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Pearson法對(duì)頸椎終板細(xì)胞凋亡指數(shù)與終板細(xì)胞密度、髓核細(xì)胞凋亡指數(shù)以及髓核蛋白多糖含量之間的關(guān)系進(jìn)行相關(guān)分析。

表1 兩組終板和髓核細(xì)胞密度比較（±s）

表1 兩組終板和髓核細(xì)胞密度比較（±s）

組別退變組外傷組t值P值n 3317終板細(xì)胞密度15.2±5.924.5±10.34.1000.000髓核細(xì)胞密度6.4±3.511.3±7.23.2300.002

2 結(jié)果

2.1 光鏡觀察結(jié)果

蘇木精—伊紅染色后獲取有效切片50份，其中退變組33份，外傷組17份。外傷組頸椎終板軟骨細(xì)胞呈圓形、橢圓形，散在或成對(duì)分布，細(xì)胞排列整齊，胞核大小均勻，著色較深，胞漿染色較淡（圖1A）；髓核中可見較多的脊索細(xì)胞和類軟骨細(xì)胞（圖1B）。退變組終板細(xì)胞數(shù)量減少，出現(xiàn)大量軟骨空陷窩（圖1C）；髓核膠原纖維增多，脊索細(xì)胞和類軟骨細(xì)胞減少，細(xì)胞周圍出現(xiàn)大量空泡（圖1D）。比較兩組的終板細(xì)胞密度和髓核細(xì)胞密度，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

2.2 終板、髓核細(xì)胞凋亡指數(shù)

TUNEL染色后去除消化過程中掉片嚴(yán)重、影響觀察結(jié)果的切片，對(duì)44份（退變組28例，外傷組16例）有效切片統(tǒng)計(jì)比較終板細(xì)胞凋亡指數(shù)；對(duì)43份（退變組26例，外傷組17例）有效切片統(tǒng)計(jì)比較髓核細(xì)胞凋亡指數(shù)。凋亡軟骨細(xì)胞表現(xiàn)為軟骨陷窩內(nèi)細(xì)胞核棕黃或棕褐染色，伴或不伴核染色質(zhì)邊集或核碎裂；非凋亡細(xì)胞胞核藍(lán)染（圖2A～2C）。髓核切片中髓核細(xì)胞密度少于終板，細(xì)胞稀疏而基質(zhì)豐富，可見散在分布的TUNEL陽性細(xì)胞（圖2D，2E）。比較退變組和外傷組的終板細(xì)胞凋亡指數(shù)和髓核細(xì)胞凋亡指數(shù)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表2）。進(jìn)一步排除年齡因素對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，選擇兩組中年齡在35～50歲的患者21例（退變組11例，外傷組10例），如表3所示，組間年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而兩組終板軟骨細(xì)胞凋亡指數(shù)的差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 蘇木精—伊紅染色結(jié)果

表2 兩組終板、髓核細(xì)胞凋亡指數(shù)比較（%，±s）

表2 兩組終板、髓核細(xì)胞凋亡指數(shù)比較（%，±s）

組別退變組外傷組t值P值終板細(xì)胞凋亡指數(shù)34.6±16.1（n=28）20.1±9.3（n=16）3.2920.002髓核細(xì)胞凋亡指數(shù)11.7±3.3（n=26）8.5±4.5（n=17）2.6860.010

2.3 髓核蛋白多糖含量

共獲取有效標(biāo)本33份，其中退變組21份，外傷組12份，比較兩組髓核蛋白多糖OD值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表4）。

2.4 終板細(xì)胞凋亡指數(shù)的相關(guān)分析

Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，頸椎終板的TUNEL染色陽性細(xì)胞率與終板細(xì)胞密度、髓核蛋白多糖含量之間呈負(fù)相關(guān)（r=—0.805，P=0.001；r= —0.677，P=0.023），與髓核TUNEL陽性細(xì)胞率之間呈正相關(guān)（r=0.758，P=0.003)。

表3 排除年齡因素影響后兩組終板細(xì)胞凋亡指數(shù)比較（±s）

表3 排除年齡因素影響后兩組終板細(xì)胞凋亡指數(shù)比較（±s）

組別退變組外傷組t值P值n 1110年齡40.20±6.9738.80±6.350.4790.637終板細(xì)胞凋亡指數(shù)32.80±12.3022.3±8.502.2520.036

表4 兩組髓核蛋白多糖OD值比較（±s）

表4 兩組髓核蛋白多糖OD值比較（±s）

組別退變組外傷組t值P值n 2112 OD值0.288±0.0280.330±0.0503.1090.004

3 討論

頸椎病發(fā)生發(fā)展的根本原因是頸椎間盤退變，而椎間盤退變的病因目前尚不明確。既往研究多集中于髓核和細(xì)胞因子[4-5]，近年來軟骨終板在椎間盤退變過程中的病理變化及其轉(zhuǎn)歸逐漸受到關(guān)注。軟骨終板為薄層透明軟骨，位于椎體上、下表面與椎間盤的纖維環(huán)和髓核之間，由軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組成，在髓核營養(yǎng)交換和椎間盤應(yīng)力保護(hù)方面起重要作用，是椎間盤主要的營養(yǎng)途徑[6]。軟骨細(xì)胞是軟骨終板中惟一的細(xì)胞類型，其功能狀態(tài)直接影響軟骨終板的功能。與細(xì)胞產(chǎn)生一樣，細(xì)胞凋亡是機(jī)體自然的生理過程，兩者并存且維持動(dòng)態(tài)平衡，以保持機(jī)體正常的生理功能和內(nèi)外環(huán)境穩(wěn)定。近年來研究發(fā)現(xiàn)退變終板中存在較高的細(xì)胞凋亡率。王擁軍等[7]通過建立動(dòng)靜力失衡頸椎間盤退變模型發(fā)現(xiàn)，退變組終板軟骨細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯增高。Ariga等[8]研究證實(shí)，病變鼠椎間盤軟骨終板內(nèi)存在凋亡細(xì)胞；隨著年齡和外在壓力的增加，細(xì)胞密度顯著降低，凋亡細(xì)胞明顯增多；細(xì)胞凋亡越明顯，軟骨終板消失越快。劉列等[9]的報(bào)道顯示，退變頸椎間盤組織中終板軟骨細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組顯著增高，陽性細(xì)胞率與細(xì)胞密度呈負(fù)相關(guān)。本研究的比較結(jié)果亦顯示，退變組終板軟骨細(xì)胞凋亡率明顯高于外傷組，因而推測終板細(xì)胞凋亡在頸椎間盤退變的發(fā)生發(fā)展過程中可能扮演重要角色。

圖2 TUNEL染色結(jié)果

隨著凋亡的發(fā)生，終板內(nèi)活細(xì)胞數(shù)量減少，殘存細(xì)胞活性降低，終板的結(jié)構(gòu)和組化成分發(fā)生改變，Ⅱ型膠原蛋白含量隨之降低，蛋白多糖丟失，水分減少，軟骨終板通透性下降，終板鈣化[10]；此外，終板細(xì)胞凋亡可造成終板軟骨細(xì)胞血管內(nèi)皮生 長 因 子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及其受體表達(dá)水平降低，軟骨下骨髓血管生成減少[11]，管腔變細(xì)。其所導(dǎo)致的軟骨鈣化及其終板下血管袢減少，還將引起髓核營養(yǎng)通路受阻，椎間盤內(nèi)營養(yǎng)減少及代謝廢物聚集，椎間盤內(nèi)的pH值、氧分壓、滲透壓等因子發(fā)生異常變化，導(dǎo)致髓核細(xì)胞在異常應(yīng)力、缺氧、炎癥因子[12-13]等因素作用下發(fā)生凋亡，細(xì)胞數(shù)量減少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，終板細(xì)胞凋亡指數(shù)與髓核細(xì)胞凋亡指數(shù)之間呈正相關(guān)，而據(jù)相關(guān)報(bào)道證實(shí)，終板退變?cè)缬谒韬送俗僛14]，因而推測終板可能是椎間盤退變的啟動(dòng)因素，終板軟骨細(xì)胞凋亡增加可通過多種途徑誘導(dǎo)髓核細(xì)胞發(fā)生凋亡。

蛋白多糖由髓核細(xì)胞分泌合成，是髓核基質(zhì)的重要成分。蛋白多糖分子中帶有大量負(fù)電荷，其與膠原及彈性蛋白結(jié)合，能調(diào)節(jié)基質(zhì)大分子間的有效孔徑，控制帶電溶質(zhì)在椎間盤中的分布和轉(zhuǎn)運(yùn)，對(duì)保持椎間盤組織和外界環(huán)境間的物質(zhì)交換具有重要作用。蛋白多糖含量降低亦是椎間盤退變的生化改變之一，其含量多少可以作為椎間盤退變嚴(yán)重的指標(biāo)之一。Hoogendoorn等[15]推測，終板軟骨細(xì)胞可合成髓核基質(zhì)物質(zhì)，終板細(xì)胞凋亡增加可能是髓核蛋白多糖含量降低的原因之一；亦有學(xué)者認(rèn)為，終板細(xì)胞凋亡可引起髓核內(nèi)環(huán)境的改變，進(jìn)而激活髓核內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶[16]，造成蛋白多糖降解增加，髓核蛋白多糖含量降低。本研究結(jié)果顯示，終板軟骨細(xì)胞凋亡指數(shù)與髓核蛋白多糖含量、髓核細(xì)胞密度均呈負(fù)相關(guān)，提示終板細(xì)胞凋亡帶來的終板結(jié)構(gòu)和組化改變可能通過抵制髓核基質(zhì)物質(zhì)形成、阻礙髓核營養(yǎng)通路、改變髓核內(nèi)環(huán)境等機(jī)制，對(duì)髓核的細(xì)胞凋亡和蛋白多糖合成造成重要影響。

本實(shí)驗(yàn)研究采用臨床病例標(biāo)本，組間各因素變量不可能達(dá)到完全齊同。為減小實(shí)驗(yàn)誤差，本實(shí)驗(yàn)采用較大樣本進(jìn)行比較，即便如此，仍不能完全避免誤差；本實(shí)驗(yàn)研究方法為橫斷面研究，證實(shí)了退變組終板細(xì)胞存在較高的凋亡率，而終板細(xì)胞凋亡導(dǎo)致髓核細(xì)胞減少、髓核蛋白多糖含量減少的結(jié)論基于統(tǒng)計(jì)分析及理論推導(dǎo)。如進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，添加實(shí)驗(yàn)干預(yù)，誘導(dǎo)終板細(xì)胞凋亡，再進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測，則可得出明確的因果關(guān)系，這需要在今后的工作中進(jìn)一步完善。

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