以血管內(nèi)皮生長因子及其受體為藥靶的抗腫瘤藥物的研究進(jìn)展

李紅，李岳，王蘭，李亞，潘克儉＊

（1.成都醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610083；2.成都康弘生物科技有限公司，四川 成都 610036）

對腫瘤生長來說，建立足夠的血管系統(tǒng)以提供氧氣和營養(yǎng)是一個必需的過程。腫瘤血管系統(tǒng)的建立，依賴于體內(nèi)促血管生成類因子誘導(dǎo)的新生毛細(xì)血管的出芽和生長［1］。Folkman［2］在1971年提出實(shí)體腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管生成（angiogenesis）這一觀點(diǎn)，并認(rèn)為抗新生血管生成療法（anti－angiogenesis）將成為一種有效的腫瘤治療方法［2］。雖然在隨后的10余年內(nèi)該觀點(diǎn)并未受到足夠重視，但后來由于堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等發(fā)現(xiàn)以及新生血管染色技術(shù)的發(fā)展，用抗新生血管生成來抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移成為近年來研究的熱點(diǎn)，F(xiàn)olkman的理論也被眾多的實(shí)驗(yàn)所證實(shí)［3，4］。

VEGF由Ferrara等人于1989年首次從牛垂體濾泡星狀細(xì)胞培養(yǎng)基中分離得到。VEGF可特異地結(jié)合于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)其增生形成新生血管，且能增強(qiáng)血管通透性。VEGF被認(rèn)為是專一、有效的刺激內(nèi)皮細(xì)胞增生的因子，它還具有增加血管通透性、趨化血管內(nèi)皮細(xì)胞等功能。以上這些功能的實(shí)現(xiàn)是依賴于VEGF與它在內(nèi)皮細(xì)胞膜上的受體結(jié)合后完成［5］。近年來關(guān)于VEGF及其受體（VEGFR）與腫瘤生長、轉(zhuǎn)移的關(guān)系，以及在將之作為靶分子進(jìn)行的抗新生血管治療腫瘤新藥開發(fā)等方面，均取得較大的進(jìn)展，目前已有數(shù)個藥物經(jīng)FDA批準(zhǔn)上市。本文就VEGF及其受體在抗腫瘤血管生成治療中的作用和研究進(jìn)展作一概述。

1 以VEGF／VEGFR為靶標(biāo)開發(fā)抗腫瘤藥物的研究概況

VEGF及其受體在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移過程中起關(guān)鍵性的作用。以VEGF或其受體為靶向的治療方式，有以下優(yōu)勢：1）已證實(shí)多種腫瘤細(xì)胞高表達(dá)VEGF，以VEGF為靶向，可達(dá)到廣譜抗腫瘤效果并且毒副作用??；2）血管內(nèi)皮細(xì)胞為二倍體細(xì)胞，遺傳性穩(wěn)定，耐藥性?。?）藥物容易到達(dá)和進(jìn)入血管內(nèi)皮細(xì)胞；4）容易通過非細(xì)胞毒性治療達(dá)到目的［6］。目前已有不少以VEGF及其受體為藥靶的抗腫瘤藥物的研究，并且取得了不錯的效果，有超過70多種候選藥物已經(jīng)被批準(zhǔn)進(jìn)入臨床試驗(yàn)，其中7種藥品已被美國FDA批準(zhǔn)生產(chǎn)上市?，F(xiàn)有可選擇性作用于VEGF／VEGFR的藥物，已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段和已被批準(zhǔn)上市的藥物（表1）。這些藥物均顯示了一定的療效，可以預(yù)見在不久的將來有更多的藥物會進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，或通過FDA審批，正式進(jìn)入臨床治療。以下就對這些治療方法做一概述。

1.1 抗體治療

對腫瘤的抗體治療研究已進(jìn)行多年，目前有18種商業(yè)化抗體已應(yīng)用于臨床腫瘤治療，例如治療乳腺癌的人源化單抗 Herceptin（抗 HER－2）、治療淋巴細(xì)胞瘤的Rituxan（抗CD20）和治療急性髓細(xì)胞白血病的Mylotarg（抗CD33）等，均已通過FDA審查。由Genentech公司開發(fā)的針對VEGF－A的單抗Avastin已在2003年完成了Ⅲ期臨床試驗(yàn)，并獲得了FDA批準(zhǔn)正式進(jìn)入臨床用于治療直腸腫瘤、非小細(xì)胞肺癌、Her2陰性乳腺癌和腎癌［7，8］及復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。Avastin是一人源化抗體（93%人源，7%鼠源），功能區(qū)為Fab段，可選擇性識別VEGF－A的各類衍生物，但不識別VEGF的其它家族分子如VEGF－B、C等，在臨床試驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)患者體內(nèi)有抗－Avastin抗體生成，并取得較好的療效。而針對VEGFR－2的單抗如DC101，已在動物實(shí)驗(yàn)中取得了初步的驗(yàn)證，但由于DC101選擇性識別的VEGFR－2是小鼠分子Flk－1，而與人類同源分子KDR并無交叉反應(yīng)，因此不能直接用于臨床試驗(yàn)。但上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以給人類腫瘤治療提供一個有意義的參考，例如設(shè)計針對人類KDR分子的人源化單抗等。ImClone公司開發(fā)的抗VEGFR－2單克隆抗體，已進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)階段［9］。至于選擇何種靶標(biāo)效果更好，是針對VEGF還是VEGFR，目前尚無定論。但有研究表明，在動物實(shí)驗(yàn)中，Avastin達(dá)到90%抑瘤效果的劑量只需要0.1～0.5mg／kg，而DC101卻需要20～30mg／kg，其原因可能是由于僅抑制VEGFR－2并不能完全控制新生血管的生長，因?yàn)橐恍┲匾δ苓€通過VEGFR－1介導(dǎo)。

1.2 小分子蛋白激酶抑制劑

可選擇性抑制VEGF及其受體酪氨酸蛋白激酶（RTK）活性的小分子合成類藥物，是近年來研究的熱點(diǎn)，許多公司都投入了大量資金進(jìn)行開發(fā)。輝瑞公司開發(fā)的SU11248（Sutent），是一類小分子RTK抑制劑，目前被批準(zhǔn)治療腎細(xì)胞癌［10］，其機(jī)理是作用于 VEGFR－1，2，3、RET 和 CSF－1。例如血小板衍生生長因子β（PDGFβ），F(xiàn)lt－3和C－kit配體。Ⅲ期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，該藥物可延緩對諾華公司抗癌藥伊馬替尼（imatinib）常規(guī)治療無效或不能耐受的胃腸道間質(zhì)瘤患者的腫瘤進(jìn)程6.3個月，而對照組僅為1.5個月，與對照組相比Sutent組可以減少死亡率50%［11］。由Byer／Onxy公司開發(fā)的Bay 43－9006本是一類RAF激酶抑制劑，后來發(fā)現(xiàn)還有較強(qiáng)的VEGFRs的RTK抑制活性和下調(diào)Mcl－1蛋白，能夠通過阻斷胞內(nèi)信號傳導(dǎo)、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤新生血管生成而發(fā)揮抗腫瘤作用。該藥物商品名又為Nexavar（Sorafenib），為首個口服激酶抑制類藥物，已通過FDA審查正式上市，治療腎細(xì)胞癌［12］與肝癌［13］。SU5416是一種類醌類衍生物，為Sugen公司（后被輝瑞公司收購）開發(fā)的一種合成的VEGFR蛋白激酶抑制劑，它能結(jié)合在腺嘌呤結(jié)合袋中而使Flk－1／KDR失活。SU5416是第一個取得臨床試驗(yàn)的抗血管小分子抑制劑，臨床前試驗(yàn)顯示了較好的抗血管生成和腫瘤抑制效果［14］；但SU5416在隨后的Ⅲ期臨床試驗(yàn)中并未顯示出明確的療效，未獲得FDA批準(zhǔn)。SU6668也是Sugen公司開發(fā)的一種小分子RTK抑制劑，但在I期臨床試驗(yàn)中由于毒副作用過大而被中止［15］。PKT787是Novartis公司合成的另外一種小分子化合物，能強(qiáng)有力的抑制VEGFR1／R2受體酪氨酸激酶，在更高一些濃度時還能抑制PDGFR－β酪氨酸激酶、c－Kit和c－Fms等。目前PKT787正在進(jìn)行轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的Ⅲ期臨床試驗(yàn)［16］。目前也通過FDA審批的抑制新生血管生成的小分子藥物還有ZD6474，由AstraZeneca公司開發(fā)，為口服的RTK抑制劑，選擇性的作用于VEGFR1／2，繼而抑制新生血管從而達(dá)到抗腫瘤效應(yīng)［17］。

1.3 核酸治療

核酸治療即利用核酶、脫氧核酶、反義核苷酸或RNA干擾來阻斷VEGF或其受體分子的轉(zhuǎn)錄或翻譯。核酶是一種RNA分子，它既有RNA特異性序列識別功能，又有位點(diǎn)特異性切割其他RNA分子的功能。反義核苷酸是指能夠與mRNA互補(bǔ)配對的單鏈DNA或RNA片斷，通常為13～25堿基對（bp），在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上可阻止蛋白質(zhì)的合成，加速mRNA的降解，具有抑制靶基因表達(dá)的作用。RNAi是一種高效的特異性強(qiáng)的基因阻斷技術(shù)，近年來發(fā)展迅速，很快就成為功能基因組研究的有力工具。通過實(shí)驗(yàn)手段將dsRNA分子導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，特異性地降解細(xì)胞內(nèi)與其序列同源的mRNA，封閉內(nèi)源性基因表達(dá)。Pavco等［18］用針對Flk－1mRNA的核酶觀察了在小鼠Lewis肺癌模型中的抗腫瘤作用，發(fā)現(xiàn)它能明顯抑制腫瘤的生長。Zhang等［19］合成了一種能消化Flk－1mRNA底物的脫氧核酶，可在體外抑制牛主動脈內(nèi)皮細(xì)胞Flk－1mRNA的表達(dá)，并抑制裸鼠體內(nèi)乳腺癌細(xì)胞的新生血管生成及腫瘤生長。Bernatchez等［20］則合成了針對Flk－1的反義核苷酸，能抑制VEGF介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移。目前已有反義核苷酸制劑如ISIS3521（特異性抑制蛋白激酶C）和ISIS5132（特異性抑制c－raf激酶）進(jìn)入腫瘤治療臨床試驗(yàn)Ⅱ期［21，22］。以 RNAi為基礎(chǔ)治療AMD的Bevasiranib（美國費(fèi)城Acuity制藥公司）能夠關(guān)閉血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）基因，能夠減緩眼睛中血管的生長并改善視力，而且試驗(yàn)中除了藥物注射位置的紅腫外，沒有觀察到其他任何副作用。第II期臨床試驗(yàn)結(jié)果將于今年9月揭曉。此外，Intradigm公司的ICS－283RNA干擾療法目前正處于臨床前研究階段，期望用于結(jié)腸直腸癌的一線治療并拓展到其他的腫瘤治療中。

1.4 可溶性VEGFR及VEGF異構(gòu)體治療

可溶性受體是指分泌到胞外的、只含有受體胞外部分的片段，它保持有同配體結(jié)合的能力，但是由于沒有胞內(nèi)的激酶活性區(qū)，因此不能進(jìn)行信號傳導(dǎo)，對正常的信號傳導(dǎo)起負(fù)調(diào)節(jié)作用。1993年Kendall等報道了一種 Flt－1的天然突變物sFlt－1（soluble Flt－1），它 只 含 有 Flt－1 胞 外 段 N 端 6 個 區(qū) 的 片段［23］。sFlt－1可以同天然的 Flt－1或 Flk－1受體形異二聚體并抑制它們介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)，因此認(rèn)為這種現(xiàn)象是一種天然的調(diào)節(jié)VEGFR功能的機(jī)制。設(shè)計和得到可溶性VEGFR的方法有以下幾種：直接用重組的方法獲得可溶性的VEGFR，從VEGFR上篩選出能與VEGF相結(jié)合的肽段，或者根據(jù)噬菌體文庫篩選的VEGF表位肽序列、并用人工方法進(jìn)行合成，等等。也有研究者設(shè)計出基于VEGF的異二聚體，其一端的受體結(jié)合區(qū)域被突變，而另一端的仍然保留；它能同受體結(jié)合，但不能介導(dǎo)受體二聚化和以后的信號傳導(dǎo)。Lu等［24］最近用重組的方法，將Flt－1單抗的可變區(qū)和KDR單抗的可變區(qū)重組成一個雙特異性的二價單鏈抗體二聚體。它既能和Flt－1結(jié)合，又能和KDR結(jié)合，并能阻斷它們同配體的結(jié)合。這種二聚體更為強(qiáng)有力的抑制VEGF的內(nèi)皮細(xì)胞增殖功能。還有研究者在VEGF上后臉接白喉毒素或志賀氏菌毒素，稱可以選擇性的抑制VEGFR和腫瘤生長［25］。但上述研究都還停留在動物實(shí)驗(yàn)階段，目前未見有進(jìn)一步臨床試驗(yàn)的報道。VEGF－trap是Regeneron公司開發(fā)的一種可溶性類似抗體結(jié)構(gòu)的融合蛋白，是將人VEGF受體Flt－1和KDR的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的一部分融合到人免疫球蛋白G的Fc片斷上，可特異性的捕獲體內(nèi)VEGF分子，阻斷其與VEGFR的結(jié)合，從而抑制新生血管的形成。研究者稱這種融合蛋白擁有比抗體如Avastin更高的親和力。目前，該藥物已進(jìn)入臨床試驗(yàn) Ⅲ 期［17］。 國 內(nèi) 與 VEGF－trap 結(jié) 構(gòu) 類 似 的KH903亦是一種抗體融合蛋白，可高效特異地阻斷VEGF與受體的結(jié)合，目前已被sFDA批準(zhǔn)進(jìn)入臨床I期。

1.5 疫苗誘導(dǎo)主動免疫治療

腫瘤疫苗主要分為DNA疫苗、蛋白質(zhì)疫苗、肽疫苗、DC細(xì)胞疫苗以及重組腺病毒疫苗等。由于VEGF及其受體在腫瘤生長過程中的重要性，開發(fā)針對VEGF及其受體的疫苗也是腫瘤治療研究的一個方向。Li等［26］用可溶性的Flk－1和DC細(xì)胞混合孵育，制備出DC－Flk－1細(xì)胞疫苗，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示該疫苗能抑制多種腫瘤的轉(zhuǎn)移，并能激發(fā)小鼠機(jī)體產(chǎn)生針對VEGFR的CTL反應(yīng)。另有研究者將攜帶Flk－1基因的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化減毒的傷寒桿菌，制成口服DNA疫苗免疫小鼠，可觀察到針對Flk－1陽性表達(dá)細(xì)胞的CTL反應(yīng)，并能抑制腫瘤在體內(nèi)的生長和轉(zhuǎn)移［27］。由于自身免疫反應(yīng)的強(qiáng)度不易控制，以及實(shí)際的VEGF／VEGFR抑制效果的穩(wěn)定性有待提高，因此這個領(lǐng)域的研究尚未進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。

2 抗VEGF治療面臨的問題和挑戰(zhàn)

VEGF治療腫瘤耐藥性問題近年越來越突出，而且缺乏有效的敏感患者篩選預(yù)測指標(biāo)。對于耐藥機(jī)制的研究，原因可能與腫瘤旁分泌的促炎癥因子募集CD11b＋髓系細(xì)胞及自分泌因子誘導(dǎo)上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)變［28，29］。為此，F(xiàn)DA新批準(zhǔn)雷帕霉素靶體（the mammalian target of rapam－ycin，mTOR）特異性抑制劑everolimus（Afinitor；諾華制藥公司）用于 VEGFR激酶抑制劑（sorafenib，sunitinib）治療耐藥的腫瘤患者［30］。此外，安全性問題亦不容忽視，如形成血栓、出血、生殖功能障礙、傷口愈合延遲及劑量相關(guān)性3～4級的高血壓［31，32］等多種毒副作用。其中，高血壓的發(fā)生機(jī)制尚不確定，有3個相關(guān)學(xué)說：（1）NO學(xué)說；（2）腎臟損傷學(xué)說；

（3）先兆子癇樣學(xué)說［33］。

表1 作用于VEGF及其受體的藥物及其試驗(yàn)進(jìn)展Tab.1 Drugs targeting on VEGF signal pathway

3 結(jié)論和展望

對于新生血管形成在各類病理過程中所起的作用，特別是對腫瘤生長促進(jìn)的作用，目前已無較大爭議，因此尋找抑制新生血管生成的分子或藥物成為目前研究的熱點(diǎn)。以VEGF家族及其相應(yīng)受體作為靶分子的藥物目前正在進(jìn)行大規(guī)模的研究，并取得了較好的效果。值得關(guān)注的是幾種已通過FDA審批的藥物，如作用于 VEGF－A的單克隆抗體Avastin、作用于VEGF165的反義核苷酸類藥物Macugen以及幾種小分子酪氨酸激酶抑制劑如ZD6474和SU11248（Sutent），等等。比較有潛力的研究領(lǐng)域是利用可溶性VEGFR及其衍生的融合蛋白，通過類似抗體的機(jī)制中和VEGF，從而達(dá)到抑制VEGF活性的作用。比較有代表性的藥物是VEGF－trap，目前已經(jīng)進(jìn)入了Ⅲ期臨床試驗(yàn)階段，據(jù)稱該類藥物相對于抗體擁有更高的選擇性和親和力。

另外，抗血管生成治療和常規(guī)的放、化學(xué)治療相結(jié)合的聯(lián)合治療，也是目前研究的熱點(diǎn)之一。大多數(shù)研究者都認(rèn)為，常規(guī)治療與抗血管生成治療的聯(lián)用可達(dá)到比單一藥物更好的效果，但其機(jī)理目前尚無定論。可能的解釋是腫瘤內(nèi)新生血管具有血管走向扭曲、內(nèi)徑大小不一、結(jié)構(gòu)紊亂等特征，可導(dǎo)致灌流不足、引起瘤內(nèi)缺氧，刺激VEGF的生成。而抗VEGF／VEGFR治療可修剪多余的不成熟的新生血管，重建腫瘤內(nèi)紊亂的血管生長結(jié)構(gòu)，從而改善血液灌流，減少由于負(fù)反饋引起的VEGF增多并增加其它藥物到達(dá)腫瘤細(xì)胞的機(jī)會。但值得注意的是聯(lián)合治療并不一定增加療效，如 Kuenen等［34］將SU5416同順鉑、健擇的聯(lián)合應(yīng)用時，發(fā)生了嚴(yán)重的血管栓塞性病變，應(yīng)引起重視。因此抗血管生成治療和常規(guī)治療聯(lián)用的方式，還需進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)結(jié)果支持，并進(jìn)行更深入的機(jī)理探討。

在研究中還需認(rèn)識到，由于VEGF／VEGFR在其他一些生理和病理過程中也發(fā)揮了重要作用，如胚胎發(fā)育、視網(wǎng)膜病變、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、宮內(nèi)膜異位癥等，因此針對VEGF及其受體的抗新生血管治療同樣適用于這些疾病。例如在老年性黃斑變性的治療研究中，抗新生血管是目前研究的熱點(diǎn)。有多種該類型藥物如Lucentis已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，反義核酸類藥物Macugen已經(jīng)上市。隨著對VEGF及其受體研究的深入，針對該領(lǐng)域的研究和相關(guān)藥物的開發(fā)將會進(jìn)入一個快速發(fā)展的階段。

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