大粒徑纖維素衍生物手性固定相合成及對(duì)普萘洛爾的手性拆分研究

楊沛，王榮，馬駿，謝華，張軍莉，賈正平#，武曉玉，王娟（.蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院藥理基地，蘭州市 730050；2.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，蘭州市 730000）

隨著對(duì)映體化學(xué)研究的不斷深入，人們?cè)絹碓秸J(rèn)識(shí)到手性化合物在醫(yī)藥、農(nóng)藥及其他生物功能材料方面的重要作用[1]。對(duì)映異構(gòu)體的手性拆分是獲得光學(xué)純物質(zhì)的有效手段，手性高效液相色譜（Chiral HPLC）是近年來迅速發(fā)展起來的手性拆分方法，在藥物、天然產(chǎn)物和不對(duì)稱合成等研究領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊[2，3]。手性HPLC的核心是手性固定相，其中由Kubota等[4，5]發(fā)展起來的多糖衍生物類手性固定相，通用性強(qiáng)、經(jīng)久耐用、樣品載荷量大[6]，被廣泛地用于各種類型外消旋化合物的分析或制備拆分中[7]。

在多糖衍生物類手性固定相中，纖維素苯基氨基甲酸酯類衍生物特別是纖維素-三（3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯）（CDMPC）對(duì)很多手性化合物都有極好的手性拆分能力[6]。Okamoto等[8]曾用CDMPC對(duì)510個(gè)消旋體進(jìn)行手性拆分，其中229個(gè)完全拆分，86個(gè)部分拆分。雖然此類手性色譜柱已商品化，但商品化的手性色譜柱均采用小粒徑硅膠（5、10μm）為基質(zhì)，雖然柱效高、分離效果好，但柱壓較高且價(jià)格昂貴，不適用于對(duì)映體的制備分離。而采用大粒徑硅膠（40～60μm）作為填料基質(zhì)，雖然柱效有所下降，但卻克服了以小粒徑硅膠作為填料基質(zhì)成本高、柱壓高的缺點(diǎn)，在手性制備柱的應(yīng)用上顯示了很好的前景。因此，本研究以分離制備手性對(duì)映異構(gòu)體為研究目的，為降低運(yùn)行成本，合成了大粒徑涂敷型CDMPC手性固定相。并根據(jù)此類固定相適合于分離胺、醇、醚及其衍生物的性質(zhì)[9]，選擇了結(jié)構(gòu)中含有羥基、氨基及醚鍵的普萘洛爾作為評(píng)價(jià)對(duì)象，通過對(duì)普萘洛爾對(duì)映體的分離評(píng)價(jià)了合成的大粒徑涂敷型CDMPC手性固定相的手性拆分性能，并探討了大粒徑手性固定相的拆分機(jī)制，為進(jìn)一步開發(fā)低成本的分析及半制備手性固定相奠定基礎(chǔ)。

普萘洛爾化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 普萘洛爾化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig 1 Chemical structure of propranolol

1 儀器與試藥

1.1 儀器

NEXUS 670傅里葉變換紅外光譜儀（美國(guó)Nicolet公司）；Vario EL元素分析儀（德國(guó)Elementar Analysensysteme GmbH公司）；液相色譜系統(tǒng)，包括LC-6A泵、SPD-6AV紫外檢測(cè)器（日本Shimadzu公司）；分析之星色譜工作站（天津奧特賽斯儀器有限公司）。

1.2 試藥

硅膠（粒徑40～60 μm）、3-氨丙基三乙氧基硅烷、3，5-二甲基苯基異氰酸酯（美國(guó)Acros Organics公司）；微晶纖維素（以下簡(jiǎn)稱纖維素，上海恒信化學(xué)試劑有限公司）；普萘洛爾標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100783-200401，純度：≥99.9%）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取普萘洛爾標(biāo)準(zhǔn)品2 mg至5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.2 手性色譜柱的制備

2.2.1 氨丙基烷化硅膠（APS）的合成。APS的合成參考文獻(xiàn)[10]，取硅膠50.08 g經(jīng)鹽酸活化后，置于1 000 mL三頸瓶中，180℃下真空干燥5 h，得活化硅膠。在N2保護(hù)下，加入500 mL無水苯（經(jīng)CaH2干燥）和9 mL無水吡啶（經(jīng)CaH2干燥），再加入3-氨丙基三乙氧基硅烷13 mL，80℃下回流反應(yīng)24 h（電磁攪拌），冷卻后，分別依次用適量的甲醇、丙酮、正己烷清洗，60℃下真空干燥5 h，產(chǎn)物置于干燥器中備用。合成反應(yīng)見圖2。

圖2 APS合成示意圖Fig 2 Synthesis diagram ofAPS

2.2.2 CDMPC的合成。參照文獻(xiàn)[11]將3.05 g纖維素置于500 mL三頸瓶中，90℃下真空干燥5 h。在N2保護(hù)下，加入120 mL吡啶，加熱回流24 h后，再加入30 mL 3，5-二甲基苯基異氰酸酯；100℃下油浴反應(yīng)48 h（電磁攪拌），冷卻至室溫，劇烈攪拌下加入大量甲醇，抽濾，得灰白色固體，再用適量的甲醇洗滌后，60℃下真空干燥24 h，得灰白色固體9.73 g，產(chǎn)率85.78%。合成路線見圖3。

圖3 CDMPC合成示意圖Fig 3 Synthesis diagram of CDMPC

2.2.3 手性固定相的涂敷。取8.02 g CDMPC溶于400 mL四氫呋喃中，過夜后取出100 mL，加入到40 g APS中，磁力攪拌20 min使其分散均勻，真空旋轉(zhuǎn)緩慢蒸發(fā)除去溶劑，此過程重復(fù)4次，最終得到以APS質(zhì)量計(jì)算涂敷量約為20%（W/W）的手性固定相。

取所得固定相3 g，以正己烷-異丙醇（90∶10，V/V）為勻漿液和頂替液，于約32 MPa壓力下裝入不銹鋼管（150 mm×4.6 mm）中。

2.3 手性固定相的表征

為考察大粒徑手性固定相合成時(shí)每步反應(yīng)的鍵合情況，采用元素分析、紅外光譜對(duì)其相關(guān)參數(shù)進(jìn)行考察。

2.3.1 APS的元素分析。對(duì)硅膠及APS進(jìn)行元素分析，結(jié)果為硅膠中氮元素（N）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)W（N）為0%，APS中W（N）為1.25%。從數(shù)據(jù)看出硅膠上無氮元素，而APS的元素分析結(jié)果中含有氮元素，說明3-氨丙基三乙氧基硅烷已鍵合到硅羥基上。

2.3.2 CDMPC的元素分析和紅外光譜分析。纖維素被酯化的程度對(duì)CDMPC手性固定相的手性識(shí)別能力有直接影響，酯化反應(yīng)越完全，固定相的手性識(shí)別能力越高。

CDMPC的碳（C）、氫（H）、氮元素分析結(jié)果[實(shí)測(cè)值（理論值）]為：W（C）[66.01%（65.66%）]，W（H）[6.42%（6.18%）]，W（N）[6.67%（6.98%）]，實(shí)測(cè)值與理論值吻合較好，說明纖維素的酯化較完全。

再比較纖維素和CDMPC的紅外光譜圖，詳見圖4。

圖4 紅外光譜圖Fig 4 IR spectrum

由圖4可見，纖維素在3 346.1 cm－1處—OH的吸收很強(qiáng)，而CDMPC在此處—OH的吸收峰已經(jīng)很弱，說明纖維素上的羥基已基本被酯化；同時(shí)在圖4B中，1 724.3 cm－1出現(xiàn)苯基氨基甲?；摹狢O吸收峰，1 615.2、1 559.7 cm－1是苯環(huán)的骨架結(jié)構(gòu)，由此說明纖維素上的—OH已基本被3，5-二甲基苯基異氰酸酯酯化。

2.3.3 CDMPC手性固定相的元素分析。按“2.2.3”項(xiàng)下涂敷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的CDMPC手性固定相的元素分析結(jié)果為：W（C）15.55%，W（H）2.13%，W（N）2.14%。而通過理論計(jì)算當(dāng)涂敷量為20%時(shí)，CDMPC手性固定相中W（N）的理論值應(yīng)為2.15%，與實(shí)測(cè)值吻合較好，說明CDMPC已按20%的涂敷量涂敷于APS上。

2.4 手性拆分性能評(píng)價(jià)

以普萘洛爾為對(duì)象，以合成的CDMPC手性固定相為手性柱，通過對(duì)色譜條件的優(yōu)化，評(píng)價(jià)在最優(yōu)的色譜條件下，手性柱的手性拆分性能。

2.4.1 色譜條件。色譜條件：色譜柱：自制的大粒徑CDMPC手性色譜柱（150 mm×4.6 mm，40～60μm）；流動(dòng)相：正己烷-異丙醇-三乙胺（不同比例）；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：276 nm；流速：0.3、0.5、0.7、0.9 mL·min－1；進(jìn)樣量：20 μL；分離均在室溫下進(jìn)行；色譜柱的死時(shí)間（t0）用1，3，5-三叔丁基苯測(cè)定。

2.4.2 流動(dòng)相比例的優(yōu)化。在涂敷型纖維素衍生物類手性固定相中，通常采用正己烷、異丙醇的正相流動(dòng)相系統(tǒng)，而普萘洛爾為堿性藥物，在流動(dòng)相中添加適當(dāng)?shù)膲A性溶液有利于其分離和改善峰形。因此，本試驗(yàn)考察了堿性添加劑三乙胺濃度為0.1%時(shí)，流動(dòng)相中正己烷、異丙醇的不同比例對(duì)普萘洛爾手性拆分的影響，以2個(gè)對(duì)映體的保留時(shí)間tR1和tR2及根據(jù)公式k1'＝（tR1－t0）/t0、k2'＝（tR2－t0）/t0而得的2 個(gè)對(duì)映體的容量因子k'、分離因子α和分離度Rs為指標(biāo)確定最優(yōu)的流動(dòng)相組成比例，考察結(jié)果詳見表1。

由表1顯示，隨著流動(dòng)相中異丙醇比例的減少，容量因子k'均變大，表明樣品在手性固定相中的保留時(shí)間延長(zhǎng)；同時(shí)分離度增加，表明異丙醇質(zhì)量比例的減少有利于樣品得到更佳的分離效果；分離因子α隨之增加，表明固定相對(duì)樣品對(duì)映體的分離效果不斷增強(qiáng)。

綜合考慮分析時(shí)間和分離效果，確定正己烷-異丙醇-三乙胺（95∶5∶0.1，V/V/V）為最佳流動(dòng)相組成比例。

表1 流動(dòng)相中正己烷、異丙醇的不同比例對(duì)分離的影響Tab 1 Effect of different proportions of n-hexane and isopropanol in mobile phase on separation

2.4.3 流速的優(yōu)化?？疾炝肆鲃?dòng)相流速分別為0.3、0.5、0.7、0.9 mL·min－1時(shí)對(duì)分離的影響，結(jié)果，流速與分離度間的關(guān)系見圖5。

圖5 流速對(duì)普萘洛爾分離度的影響Fig 5 Effect of flow rate on separation rate of propranolol

由圖5可見，流速?gòu)?.9 mL·min－1減小到0.5 mL·min－1時(shí)，分離度增大，達(dá)到基線分離。這是由于對(duì)映體在纖維素衍生物上的手性識(shí)別作用能量差極小，對(duì)映體間的完全分離有賴于溶質(zhì)與固定相之間的多次相互作用。流速?gòu)?.5 mL·min－1減小到0.3 mL·min－1時(shí)，雖然分離度有所增加，但色譜峰加寬，分析時(shí)間延長(zhǎng)，柱壓上升。綜合考慮分離效果、分析時(shí)間和柱壓等各方面因素，選擇0.5 mL·min－1為較適宜流速。

通過對(duì)流動(dòng)相、流速的優(yōu)化，最后確定了普奈洛爾分離的流動(dòng)相為正己烷-異丙醇-三乙胺＝95∶5∶0.1（V/V/V，使用前均經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾并超聲脫氣15 min），流速為0.5 mL·min－1。2.4.4 樣品拆分。此條件下樣品的手性拆分色譜見圖6（其中，2個(gè)對(duì)映體的確定是通過旋光儀測(cè)定區(qū)分）。

圖6 普萘洛爾的手性拆分圖譜Fig 6 Chromatogram of chiral separation of propranolol

2.5 手性柱的穩(wěn)定性

將所制備的CDMPC手性柱在正相條件下連續(xù)使用2個(gè)月（約450 h），共進(jìn)樣約900針，考察柱壓和分離度的變化。結(jié)果，柱壓由386 psi變?yōu)?35 psi，變化率為12.7%，表明柱壓值一直較低且無明顯升高；分離度由1.67變?yōu)?.62，分離度下降了2.99%，表明手性拆分能力及柱效均無明顯下降現(xiàn)象，這說明制備的CDMPC手性柱具有良好的穩(wěn)定性。

2.6 CDMPC拆分普萘洛爾的機(jī)制分析

由于CDMPC手性固定相是具有左旋三重（3/2）螺旋型空穴的光學(xué)活性分子，3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯基團(tuán)圍繞纖維素主鏈形成許多手性空腔，在手性空腔中，靠近纖維素主鏈的外側(cè)是芳基，內(nèi)側(cè)是手性固定相的氨基甲酸酯殘基，對(duì)手性化合物有很好的選擇性。此外，纖維素類固定相的螺旋型空穴對(duì)進(jìn)入空腔的芳環(huán)部分有很高的親和力，形成“立體配合”的包結(jié)作用[12]。普萘洛爾手性中心附近含有羥基和氨基，當(dāng)其調(diào)整構(gòu)象進(jìn)入螺旋槽中，其結(jié)構(gòu)中的羥基和氨基可與CDMPC酰胺鍵產(chǎn)生氫鍵作用，萘環(huán)與CDMPC中的苯環(huán)存在π-π作用，甲基與CDMPC中的甲基形成范德華力，從而與固定相形成締合物，由于2個(gè)對(duì)映異構(gòu)體所形成的締合物的穩(wěn)定性不同而達(dá)到手性分離。普萘洛爾在CDMPC手性凹槽內(nèi)的超分子鍵聯(lián)示意圖見圖7。

圖7 普萘洛爾在CDMPC手性凹槽內(nèi)的超分子鍵聯(lián)示意圖Fig 7 Diagram of supra-molecular bindings of propranolol in chiral groove of CDMPC

由圖7顯示，普萘洛爾能與CDMPC形成3個(gè)π-π作用、2個(gè)氫鍵作用和1個(gè)范德華力，從而使普萘洛爾在此固定相上獲得了較好的手性拆分[13]。

3 討論

纖維素衍生物類手性固定相由于其拆分的手性化合物范圍廣，樣品載樣量大，非常適合于手性藥物的制備分離。但由于常規(guī)的小粒徑（5μm）手性柱存在柱壓高、易堵塞、壽命較短等缺點(diǎn)，限制了其在制備分離上的應(yīng)用。因此，本文采用大粒徑硅膠顆粒（40～60μm）制備了涂敷型CDMPC約45 g，達(dá)到半制備色譜柱所需的填料要求。將3 g該填料裝填在不銹鋼管中獲得涂敷型CDMPC手性分析柱，并通過對(duì)普萘洛爾對(duì)映體的分離評(píng)價(jià)了其手性拆分性能。結(jié)果在正相條件下普萘洛爾對(duì)映體的分離度達(dá)1.67，表明合成的CDMPC填料具有良好的手性拆分性能。

通過以大粒徑硅膠顆粒為填料基質(zhì)，不僅降低了小粒徑手性柱制備中硅膠基質(zhì)的原料費(fèi)用，同時(shí)，由于填料孔徑大、填料間的空隙大，減小了對(duì)流動(dòng)相的阻力，因此有效地避免了小粒徑手性柱柱壓高、易堵塞等缺點(diǎn)，在制備纖維素類手性柱的應(yīng)用上顯示出了更大的優(yōu)勢(shì)，在手性藥物的制備分離上顯示了很好的應(yīng)用前景。

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