黑虎掌菌多糖的組成和抗腫瘤活性*

陳健 張靈芝 韋丁 徐曉飛

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510640)

黑虎掌菌，學名翹鱗肉齒菌(Sarcodon imbricatus)，該菌菌體上長滿一層細茸毛，呈黃褐色，并有明顯的黑色花紋，形同虎爪，因而得名.國外主要分布于日本、德國，國內主要分布于云南、西藏等地.我國具有長期采集食用黑虎掌菌的歷史，民間還有用它入藥的記錄［1］.黑虎掌菌在歷史上被視為名貴山珍，是歷代宮廷喜愛的貢品之一［2］.

國際上，多糖被稱為“生物應答效應物”，能增強人體的免疫功能，對腫瘤的生長有一定的抑制作用.目前最常用的體外抗腫瘤藥物篩選方法有3種，分別是四甲基偶氮唑鹽(MTT)微量酶反應比色法、四唑氮衍生物(XTT)法和磺基羅丹明B(SRB)法，其中MTT法實驗周期短，所需細胞數(shù)目較少，所得資料較準確，是藥物篩選的主要手段［3］.

目前對黑虎掌菌多糖的研究很少，特別是關于純化多糖抗腫瘤活性的研究鮮見報道.文中分析了兩種黑虎掌菌子實體純化多糖的光譜特征及單糖組成，評價了它們在體外的抗腫瘤活性，以期為黑虎掌菌子實體多糖的開發(fā)利用提供科學依據(jù).

1 實驗部分

1.1 材料及儀器

主要實驗材料如下:黑虎掌菌，購于廣州一德路干貨市場;D354FD樹脂，廣州市廣聯(lián)津化工有限公司生產;單糖標準品葡萄糖、巖藻糖、木糖、甘露糖及半乳糖，美國Sigma公司生產;Whatman DEAE-52，廣州展晨生物科技有限公司進口分裝;Sepharose CL-6B，美國 Pharmacia公司生產;完全RPMI-1640培養(yǎng)基、MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒，南京凱基生物公司生產;其它試劑均為國產分析純.

主要實驗儀器如下:DZTW型調溫電熱套，北京市永光明醫(yī)療儀器廠生產;旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器生產;721-P型分光光度計，上?，F(xiàn)科儀器有限公司生產;BT-200型恒流泵、DBS-100型自動部分收集器，上海滬西儀器廠生產;冷凍干燥系統(tǒng)、3543型培養(yǎng)箱，美國 Thermo公司生產;Vector 33型傅里葉變換紅外光譜儀，德國Bruck公司生產;液相色譜系統(tǒng)，美國Waters公司生產;氣相色譜系統(tǒng)，美國Aglient公司生產;680型酶標儀，美國伯樂公司生產;CK40-F200型倒置顯微鏡，日本Olympus公司生產.

1.2 黑虎掌菌多糖的分離純化工藝

黑虎掌菌子實體干品用95%(體積分數(shù)，余同)的乙醇回流提取3次，混合物過濾，殘渣用熱水回流提取3次，混合物抽濾，濾液合并后減壓濃縮，添加無水乙醇至乙醇含量為75%，于4℃冰箱過夜，混合液于4 000 r/min離心15 min，沉淀復溶，將糖液和Sevage試劑(三氯甲烷/正丁醇體積比為5∶1)混合，兩者體積比為5∶1，震蕩20min，離心，取上部糖液添加D354FD樹脂脫色，經過脫色的糖液透析后減壓濃縮，濃縮液過DEAE-52陰離子柱層析，收集洗脫液并濃縮，透析，之后過Sepharose CL-6B凝膠柱層析，收集洗脫液并濃縮，透析，最后冷凍干燥得到兩種多糖SIPa和SIPb.

1.3 SIPa和SIPb的相對分子質量測定

SIPa和SIPb的均一程度和相對分子質量用高效凝膠滲透色譜測定.樣品配制成1 g/L的水溶液，用0.45μm微孔濾膜過濾后進樣.色譜條件為:TSKGEL G-4000PWXL柱(7.8 mm×300 mm)與TSKGEL G-2500PWXL柱(7.8mm ×300mm)串聯(lián)，流動相為0.02mol/L的KH2PO4溶液，流速為0.6mL/min，柱溫為35℃.

1.4 紅外光譜分析

分別取約2 mg SIPa和 SIPb，與KBr混合研細后，在4000～400cm－1范圍內進行紅外掃描.

1.5 單糖組成分析

多糖的水解:分別稱取10 mg SIPa和SIPb放入小管中，加2 mL 2 mol/L的三氟乙酸，充氮氣封管，110℃水解3 h.將水解液減壓蒸干，加1.5 mL甲醇溶解，再減壓蒸干，重復多次以除盡殘余的三氟乙酸.

衍生化:分別往SIPa和SIPb的水解物、單糖標準品中加入10mg鹽酸羥胺和1 mL吡啶，90℃水浴30min并振蕩，冷卻至室溫，加入醋酸酐1 mL，繼續(xù)于90℃水浴中保持30min，生成具有揮發(fā)性的糖腈乙酸酯衍生物.

氣相色譜條件:采用 Aglient 6890N氣相色譜儀、DB-1701毛細管柱(30m×0.25m×0.25μm)及氫火焰離子化檢測器;高純氮作載氣，流速為1mL/min.程序升溫:柱初始溫度為180℃，以2℃/min升至220℃，保持 1 min，以 5℃/min升至 250℃，保持2min;進樣口溫度為250℃，分流比為1∶14.5，汽化室溫度為250℃，檢測器溫度為300℃，吹掃流速為4.0mL/min.

1.6 黑虎掌菌多糖的抗腫瘤活性實驗

取對數(shù)生長期的貼壁細胞，1 000 r/min離心10min，用0.25%的胰蛋白酶溶液消化后，用10%(體積分數(shù))小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋.用玻璃滴管輕輕吹打成單細胞懸液，顯微鏡下用血細胞計數(shù)板計數(shù)，制成5×104個/mL的細胞懸液.

往96孔培養(yǎng)板中加入200μL配制好的細胞懸液，最外一層加200 μL磷酸鹽緩沖液(PBS)，封口，置37℃、5%(體積分數(shù))CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h.倒掉原培養(yǎng)基，再加入180 μL培養(yǎng)基，分別加入不同濃度的SIPa和SIPb水溶液20 μL，以三蒸水為溶劑對照組，以不加細胞和多糖溶液的培養(yǎng)基為空白對照組，每組5個平行樣.封口繼續(xù)培養(yǎng)48 h，取出培養(yǎng)基，加PBS清洗后，每孔再加入180 μL培養(yǎng)基和20μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h.小心吸棄上清液，然后每孔加150μL二甲基亞楓，輕輕振蕩使深藍色沉淀物完全溶解，約1 h后用酶標儀測定492 nm波長下各孔吸光值，測定需減去空白對照［4］.腫瘤細胞生長抑制率計算公式為

2 結果與討論

2.1 黑虎掌菌多糖的柱層析分離純化

多糖分子一般為中性或酸性帶負電荷的大分子，因此采用陰離子交換柱層析分離黑虎掌菌多糖.

如圖1所示，黑虎掌菌多糖的DEAE-52柱層析水洗脫后得到一個峰，收集6到16管;透析后再過Sepharose CL-6B凝膠柱層析，得到兩個洗脫峰，8到16管收集后冷凍干燥得SIPa，17到28管為SIPb.

圖1 黑虎掌菌多糖的柱層析圖Fig.1 Elution patterns of polysaccharides from Sarcodon imbricatus with column chromatography

2.2 SIPa和SIPb的相對分子質量和純度

圖2是黑虎掌菌多糖SIPa和SIPb的高效凝膠滲透色譜圖.SIPa的峰位相對分子質量為242769，重均相對分子質量Mw為2.12×105;SIPb的峰位相對分子質量為10 727，重均相對分子質量Mw為1.05 ×104.

多糖相對分子質量多分散性程度用相對分子質量分布指數(shù)D表示，即Mw/Mn，其中Mn為數(shù)均相對分子質量.D=1時，是相對分子質量均一的聚合物，D越大其相對分子質量分布越寬，多分散性程度越大［5］.SIPa和 SIPb的D值分別為 1.25 和 1.10，表明SIPa、SIPb均為相對分子質量分布比較集中的多糖.此外，用凝膠柱層析法分別對SIPa和 SIPb驗純，結果如圖3所示，其洗脫曲線均為單一對稱峰.高效凝膠滲透色譜法和凝膠柱層析法的檢測結果證明，SIPa和SIPb均為單一成分多糖.

圖2 SIPa和SIPb的高效凝膠滲透色譜圖Fig.2 High-performance gel permeation chromatograms of SIPa and SIPb

圖3 SIPa和SIPb的Sepharose CL-6B柱層析圖Fig.3 Elution patterns of SIPa and SIPb on Sepharose CL-6B column

2.3 SIPa和SIPb的化學結構

SIPa和SIPb的紅外吸收情況如圖4所示.由圖4可見:SIPa和SIPb在3410cm－1附近有強吸收，屬于O—H伸縮振動的特征吸收;2930 cm－1附近的弱吸收代表CH3、CH2、CH等的C—H伸縮振動;1614cm－1附近的較強吸收以及1400～1200 cm－1的弱吸收都屬于多糖的特征紅外吸收［6］.上述3種紅外吸收都是糖類的特征吸收峰，因此可確認SIPa和SIPb均為糖類化合物.此外，1300～1000 cm－1處的吸收屬于吡喃環(huán)的伸縮振動，所以SIPa和SIPb都是吡喃環(huán)結構［7］.SIPa 具有 895 cm－1處的吸收，代表 C1—H豎變角振動，表示該多糖以β型吡喃糖苷為主;在異頭碳區(qū)(950 ～700 cm－1)及 920、809 cm－1處的明顯吸收與甘露糖的存在相對應［8］，因此 SIPb含有甘露糖.

圖4 SIPa和SIPb的紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectra of SIPa and SIPb

2.4 SIPa和SIPb的單糖組成

菌類多糖一般是由鼠李糖、巖藻糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖等單糖組成，根據(jù)單糖組成情況可分為5類，即雜多糖、甘露聚糖、葡聚糖、糖蛋白和多糖肽［9］.對于不同種類的真菌、不同提取方法和提取部位，單糖組成會存在差別.

圖5為單糖標準品和SIPa、SIPb的糖腈乙酸酯衍生物的氣相色譜圖，圖5(a)中的5個峰(9.862、11.017、16.362、17.483、18.304min 處)分別表示標準巖藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖.圖5(b)顯示SIPa為葡聚糖，只含葡萄糖;SIPb為雜多糖，單糖組成為巖藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，摩爾比為8.93∶1∶4.25∶29.18.在研究比較多的菌類多糖中，類似于SIPa屬于葡聚糖的有香菇多糖、裂褶多糖，二者都具有抗腫瘤、提高細胞免疫及體液免疫的功能［10］;類似于SIPb，單糖組成中含有巖藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的多糖有棘托竹蓀多糖，它對小鼠肉瘤S-180具有一定的抑制作用，其平均抑制率為 38.93%［11］.

2.5 SIPa和SIPb的抗腫瘤活性

圖5 單糖標準品、SIPa和SIPb的氣相色譜圖Fig.5 Gas chromatograms of standard monosaccharide，SIPa and SIPb

多糖的抗腫瘤作用大小可能與提取方式、提取部位，以及多糖水溶液的相對分子質量、大小、分支度、化學結構等相關.文獻［12］的結果顯示，用超聲法從側茸菌核和菌絲中提取的多糖的相對分子質量比用熱水提取法的高，用熱水提取的多糖比用超聲法提取的抗腫瘤活性高;提取方法相同時，從側耳菌核中提取的多糖的相對分子質量越高，抗腫瘤活性也越強.相對分子質量適中的(5.0×105～15.0×105)香菇多糖活性比相對分子質量很低或者很高的多糖的抗腫瘤活性都強［13］.相對于空白對照組，SIPa和SIPb對Hep G2和HO-8910細胞的增殖都有抑制作用(見表1)，濃度越高，抑制作用越明顯，呈劑量依賴性;以SIPb對HO-8910的抑制作用最為顯著，最高抑制率為28.51%.SIPb較強的抗腫瘤活性可能與其單糖組分中的甘露糖和葡萄糖有關，因為人體的巨噬細胞有一個多糖受體，該受體對葡萄糖和甘露糖有高度專一性［14］，故含有葡萄糖和甘露糖的菌類多糖可能具有抗癌活性［15］.

3 結語

文中通過水提醇沉、除蛋白、脫色、離子交換柱層析和凝膠柱層析分離純化得到兩種相對分子質量分布比較集中的黑虎掌菌子實體多糖組分SIPa、SIPb，紅外光譜結果證明它們都是多糖類物質.單糖組成分析顯示，SIPa只含有葡萄糖，SIPb含有巖藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖.MTT實驗表明，SIPa和SIPb對人肝癌細胞Hep G2和人卵巢癌細胞HO-8910的增殖都有抑制效果，有進一步研究利用的價值.但對其高級結構、構效關系和藥理的研究還不夠深入，且生長環(huán)境不同、培養(yǎng)條件不同、提取分離技術不同都會造成多糖結構的差異，都會影響其活性;因此，還需要進一步準確分析黑虎掌菌多糖的結構，以充分開發(fā)利用其價值.

表1 黑虎掌菌多糖對Hep G2和HO-8910細胞增殖的抑制作用1)Table 1 Growth inhibition of cells Hep G2 and HO-8910 by SIPa and SIPb

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