大分子擁擠體系下葡聚糖對SPI的共價修飾*

齊軍茹 卓秀英 楊曉泉 尹壽偉 黃立新

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640)

“大分子擁擠”是生命科學(xué)領(lǐng)域中的研究熱點［1］，生命細胞內(nèi)含有大量的大分子物質(zhì)如多糖、蛋白質(zhì)、核酸等，這些大分子以很高的濃度存在，使細胞內(nèi)環(huán)境變得異常擁擠，大多數(shù)的生化反應(yīng)是在這種擁擠的環(huán)境體系中完成的.因此，近幾年生命科學(xué)家強烈建議把“大分子擁擠”環(huán)境與pH、離子強度和溶液組成等常規(guī)因素一樣用于研究生物大分子，加入擁擠物質(zhì)逐漸成為一種研究大分子的途徑［2］.

蛋白質(zhì)和多糖是共存于食品乳化體系中的最重要的兩類生物大分子，是影響食品結(jié)構(gòu)和功能的主要因素.蛋白質(zhì)因能在液—液或氣—液界面上形成吸附層，降低界面張力，多在膠體體系中充當(dāng)乳化劑;多糖則由于其良好的增稠性和持水性而常用作穩(wěn)定劑.與以次級力結(jié)合的蛋白質(zhì)－多糖體系相比，共價鍵結(jié)合的蛋白質(zhì)與多糖形成大分子復(fù)合物，既保留了蛋白質(zhì)的表面活性又具有多糖的親水性能，具有較高的環(huán)境適應(yīng)性，其結(jié)合不受熱或pH值的影響［3］.就乳化性能而言，大分子復(fù)合物優(yōu)于某些商業(yè)小分子乳化劑［4-5］;引入糖鏈后，蛋白質(zhì)的溶解度、抗氧化性、抗菌性以及熱穩(wěn)定性等性能提高［5-6］.

當(dāng)體系中存在高濃度的生物大分子時，大分子之間的反應(yīng)遵循分子排斥容積理論［7］，促進反應(yīng)向溶質(zhì)總體積減小的方向，即朝結(jié)合方向移動［8］;此外，大分子擁擠環(huán)境下蛋白質(zhì)分子構(gòu)型趨于穩(wěn)定，蛋白質(zhì)變性程度以及聚集程度將會減小［9］.筆者前期研究了乙醇體系中大豆分離蛋白－葡聚糖共價復(fù)合物的制備及機理，結(jié)果表明乙醇通過控制水分活度對Maillard反應(yīng)有促進作用［10］.基于大分子擁擠理論，文中將多糖(葡聚糖)和蛋白質(zhì)(大豆分離蛋白)作為生物大分子形成高濃度的大分子擁擠環(huán)境，進行Maillard反應(yīng)，探討了葡聚糖對大豆分離蛋白的共價修飾作用;與乙醇體系不同，大豆分離蛋白和葡聚糖不僅僅是反應(yīng)試劑，而且是擁擠試劑.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

主要材料與試劑如下:實驗用大豆低溫脫脂豆粕，購自山東東營蛋白廠;葡聚糖(相對分子質(zhì)量為60000～90000)，購自Sigma公司;無水乙醇和甲醇等試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.2 儀器和設(shè)備

主要儀器和設(shè)備如下:Q100型差示掃描量熱儀，美國TA Instruments公司生產(chǎn);1525型凝膠滲透色譜儀，美國Waters公司生產(chǎn);MOS 450型圓二色光譜儀，法國BIO-LOGIC公司生產(chǎn);Mastersizer 2000型粒度分布儀，英國Malvern Instruments公司生產(chǎn).

1.3 實驗方法

1.3.1 大豆分離蛋白的制備

大豆分離蛋白(SPI)的制備方法見文獻［10］.

1.3.2 蛋白 －多糖干熱反應(yīng)

將大豆分離蛋白與葡聚糖按質(zhì)量比1∶1混合并溶解，調(diào)混合物總質(zhì)量濃度至60 g/L，冷凍干燥.物料過120目篩后放置在有飽和KBr溶液的容器內(nèi)，保持相對濕度為79%，在60℃下恒溫反應(yīng)5d，得到干熱復(fù)合物(DHC).

1.3.3 SPI和葡聚糖的交聯(lián)

分別稱取1g大豆分離蛋白和一定量的葡聚糖，加入pH值為6.5的磷酸鹽緩沖液10 mL，攪拌2 h至完全溶解，添加0.2%NaN3數(shù)滴，置于5℃過夜;之后保持恒溫，攪拌加熱一段時間后，4℃下透析24h，于20℃在10000g離心30 min，取上清液，冷凍干燥，得到大豆分離蛋白－葡聚糖共價復(fù)合物(SDC).

1.3.4 接枝度的測定

采用鄰苯二甲醛(OPA)法［11］測定接枝度.稱取40mg的 OPA溶解于1 mL的甲醇中，分別加入2.5mL 200g/L的十二烷基磺酸鈉(SDS)、25 mL 0.1mol/L 的硼砂、100μLβ-巰基乙醇，最后用蒸餾水定容至50 mL，得到OPA試劑.取OPA試劑4 mL于試管中，分別注入200 μL樣品液，混勻后于35℃反應(yīng)2min，340nm下測其吸光值.由此可得接枝度G:

式中，D0為接枝反應(yīng)前溶液的吸光值，D1為接枝反應(yīng)后溶液的吸光值.

1.3.5 乳化活性的測定

樣品用去離子水配制成2%(質(zhì)量分數(shù))的溶液，加入含量為20%(體積分數(shù))的花生油溶液，30MPa高壓均質(zhì)2次，制成乳狀液，用去離子水按質(zhì)量比1∶1000稀釋，采用粒度分布儀測定乳狀液中粒子大小及其分布［12］.參數(shù)設(shè)置如下:顆粒折射率為1.520，分散劑折射率為1.330.

1.3.6 熒光光譜分析

采用1-苯胺基萘-8-磺酸鹽(ANS)熒光探針法［13］進行分析.將加熱后的糖基化產(chǎn)品用0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH=7.0)稀釋為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為0.1 g/L的待測樣，檢測前取20 μL ANS溶液(8mmol/L)加到4mL待測液中混合均勻，激發(fā)波長為390nm(狹縫5 nm)，迅速進行400～600 nm的波長掃描.

1.3.7 其它分析方法

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、熱穩(wěn)定性測定、凝膠滲透色譜分析及圓二色光譜儀分析的具體方法參考文獻［10］.

2 結(jié)果與分析

2.1 Maillard反應(yīng)條件的確定

Maillard反應(yīng)中，蛋白質(zhì)中的游離氨基對側(cè)鏈進行修飾，文中通過游離氨基的變化情況表征Maillard反應(yīng)的程度，即接枝度.

在反應(yīng)體系中，蛋白質(zhì)分子有一個肽鏈展開、游離氨基暴露的過程，隨著反應(yīng)的進行，游離氨基參與了羰氨反應(yīng)，形成共價結(jié)合物，體系游離氨基逐漸減少，接枝度升高.當(dāng)SPI/葡聚糖質(zhì)量比為2∶1、1∶1、1∶2、1∶3 時，對應(yīng)的接枝度分別為 20.21%、62.72%、63.19%、44.65%，接枝度隨葡聚糖濃度的升高先升高后降低.這是因為:體系越擁擠，與SPI的接觸面越大，有利于反應(yīng)的進行，接枝度增大，但是同時葡聚糖的空間位阻也增加，會阻礙共價交聯(lián)的進行，過大的葡聚糖濃度會使接枝度減小.可見，SPI/葡聚糖的最佳質(zhì)量比為1∶1(質(zhì)量比為1∶2時所耗葡聚糖過多).當(dāng)反應(yīng)時間為 18、24、30、36 h時，對應(yīng)的接枝度分別為44.79%、56.48%、62.70%、62.91%，可見，反應(yīng)時間增加，接枝度提高，當(dāng)反應(yīng)時間達到30 h時，其接枝度與36 h時基本相當(dāng).在Maillard反應(yīng)中，當(dāng)反應(yīng)溫度為 50、55、60、65℃時，對應(yīng)的接枝度分別為30.73%、49.92%、62.84%、62.99%，可見，隨著反應(yīng)溫度的升高，接枝度提高，當(dāng)反應(yīng)溫度從60℃升高到65℃時，接枝度增加不明顯.因此，可確定Maillard反應(yīng)的適宜條件為:SPI/葡聚糖質(zhì)量比為1∶1，反應(yīng)時間為30h，反應(yīng)溫度為60℃.

2.2 電泳圖譜分析

圖1為考馬斯亮藍染色和糖蛋白染色的電泳圖譜.在考馬斯亮藍染色圖譜中，SDC的條帶中分離膠與濃縮膠界面有相對分子質(zhì)量較大且集中的物質(zhì)生成，在上樣孔與濃縮膠界面生成了相對分子質(zhì)量更大的聚集物，有大量難以進入濃縮膠的大分子物質(zhì)，而未加熱和加熱的SPI條帶沒有這兩種現(xiàn)象.在糖蛋白染色圖譜中，對應(yīng)考馬斯亮藍染色圖譜中的大分子區(qū)域均有聚合產(chǎn)物條帶，表明SDC為共價結(jié)合的糖蛋白.

圖1 考馬斯亮藍染色和糖蛋白染色的電泳圖譜Fig.1 Electrophoretograms with coomassie brilliant blue staining and carbohydrate staining

結(jié)合接枝度分析的結(jié)果可知，模擬大分子擁擠體系可以大大縮短反應(yīng)時間，擁擠體系只需30 h就可完成反應(yīng)，而傳統(tǒng)的干熱反應(yīng)需5天.這是因為水相反應(yīng)中可以自由攪拌，克服了干熱反應(yīng)不均勻的缺點，最大程度地讓多糖和蛋白質(zhì)充分接觸，從而加快了反應(yīng)速度.這說明了模擬大分子擁擠體系進行Maillard反應(yīng)的可行性和有效性.

2.3 乳化活性

圖2示出了各樣品的乳化活性.乳狀液中的粒度分布是影響乳狀液穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素，也是評價樣品乳化活性的重要指標(biāo).乳狀液粒子越大，乳析過程越快，乳析率越高.由圖2可知:SDC的乳液粒徑小，乳化活性高，且穩(wěn)定性好;質(zhì)量比為1∶1的SPI/葡聚糖混合物的乳液粒徑偏高，表明未經(jīng)Maillard反應(yīng)的混合物中蛋白質(zhì)的乳化活性沒有得到改善;SPI單獨加熱所得產(chǎn)物的乳液粒徑明顯較大，說明在加熱過程中蛋白質(zhì)發(fā)生了熱聚集，從而導(dǎo)致粒徑增大，乳化活性降低.顯然，大分子擁擠環(huán)境中，葡聚糖糖鏈的鍵入可有效抑制蛋白質(zhì)的熱聚集.該現(xiàn)象表明，大分子擁擠體系中Maillard反應(yīng)制備的蛋白

圖2 乳化活性的比較Fig.2 Comparison of emulsifying activity

2.4 疏水性分析

圖3為產(chǎn)物加熱后的外置熒光光譜.利用ANS作為熒光探針的外置熒光光譜可以分析蛋白質(zhì)疏水基團暴露的情況.ANS連接到芳香族氨基酸如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸的支鏈上，因而熒光強度與蛋白質(zhì)的疏水性直接相關(guān)［14］，熒光強度越大，疏水性越強.由圖 3可知，熒光強度的高低順序為:SPI＞SPI/葡聚糖混合物＞SDC.這說明以共價鍵形式鍵入的葡聚糖能夠與芳香族氨基酸共價結(jié)合，減少蛋白質(zhì)表面的疏水基團，降低由于疏水作用導(dǎo)致的蛋白質(zhì)聚集.

圖3 對照樣品和SDC的外置熒光光譜Fig.3 Exterior fluorescence emission spectra of control samples and SDC

2.5 熱穩(wěn)定性分析

圖4為SDC和SPI的差示掃描量熱(DSC)圖譜.加熱是蛋白質(zhì)加工中不可避免的工序，而蛋白在熱作用后會發(fā)生變化(如聚集、分子結(jié)構(gòu)變化等)，因而影響其功能.由圖4可知，三者均呈現(xiàn)了一至兩個吸收峰，這是SDC和SPI的熱變性峰.其中SDC的變性溫度較高，為105.17℃，變性焓為25.600J/g，兩項指標(biāo)都高于加熱和未加熱處理的SPI，表明大分子擁擠體系中，蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性提高了.原因可能是由于葡聚糖分子糖鏈的鍵入，分子的凈負電荷增加，空間位阻增大，靜電排斥作用增強［15］，因此接枝的復(fù)合物在熱作用下不易發(fā)生聚集［16］，熱穩(wěn)定性得到提高.

圖4 SDC和SPI的DSC圖譜Fig.4 DSC profiles of SDC and SPI

2.6 相對分子質(zhì)量分析

圖5為對照樣品和SDC的凝膠滲透色譜圖，根據(jù)所測標(biāo)準(zhǔn)樣品的數(shù)據(jù)，當(dāng)洗脫時間為12.97 min時，對應(yīng)的相對分子質(zhì)量為669000;當(dāng)洗脫時間為15.83min時，對應(yīng)的相對分子質(zhì)量為158000;當(dāng)洗脫時間為17.06 min時，對應(yīng)的相對分子質(zhì)量為43000.比較可知，與SPI相比，SDC的吸收峰發(fā)生明顯變化，且洗脫峰位置前移，說明生成了聚合物;相對分子質(zhì)量變大，說明糖基化處理后，大分子的分散度提高，蛋白與糖交聯(lián)后其產(chǎn)物為各種不同相對分子質(zhì)量的物質(zhì)組成的混合物，其中高相對分子質(zhì)量的物質(zhì)較多，與2.2節(jié)中的電泳圖譜分析結(jié)果一致.

圖5 對照樣品和SDC的凝膠滲透色譜Fig.5 Gel permeation chromatograms of control samples and SDC

2.7 蛋白質(zhì)二、三級結(jié)構(gòu)分析

圖6(a)示出了對照樣品和SDC二級結(jié)構(gòu)的變化情況.研究表明，典型的α螺旋結(jié)構(gòu)蛋白在192nm處有明顯正吸收峰，在208nm及222nm處有兩個明顯負吸收峰，β折疊結(jié)構(gòu)在196 nm處有一正的譜帶，在206 nm處有一負的譜帶［17］.與SPI的二級結(jié)構(gòu)組成相比，兩種糖基化產(chǎn)物二級結(jié)構(gòu)的主要結(jié)構(gòu)與SPI一樣，仍以β折疊結(jié)構(gòu)為主，而α螺旋含量均有不同幅度的減少，無規(guī)則卷曲含量都增加.這說明蛋白質(zhì)肽鏈中引入較長的糖鏈，抑制了蛋白質(zhì)分子聚集，空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，柔韌性有所增加［18］.與干熱產(chǎn)物DHC的二級結(jié)構(gòu)略有不同，SDC的α螺旋結(jié)構(gòu)減少的幅度較大，原因可能是水溶液更有利于反應(yīng)的進行，反應(yīng)程度更高，隨著葡聚糖分子的接入，空間位阻增大，α螺旋結(jié)構(gòu)迅速減少，蛋白質(zhì)展開逐漸趨于穩(wěn)定.

圖6 對照樣品和SDC的圓二色譜分析Fig.6 Circular dichroism spectra of control samples and SDC

對照樣品和SDC三級結(jié)構(gòu)的近紫外圖譜如圖6(b)所示.圓二色譜的近紫外圖譜反映了蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團的變化，主要是芳香族氨基酸，如色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)［19］.圖6(b)中SDC圖譜變化大，曲線主要波動出現(xiàn)在250～290nm內(nèi)，表明擾動主要發(fā)生在Phe、Tyr殘基及二硫鍵附近.糖鏈的接入能引進較大的空間位阻，較大程度地屏蔽掉近紫外區(qū)有信號的芳香族氨基的圓二信號，尤其在Phe的特征信號范圍250～265 nm內(nèi)，圓二信號負值增強，說明在糖基化過程中苯丙氨酸減少，可能與葡聚糖發(fā)生了共價交聯(lián).結(jié)合近紫外和遠紫外圓二色譜分析可知，糖基化產(chǎn)物的二、三級結(jié)構(gòu)都發(fā)生了明顯的變化，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的柔韌性有所增強，這將更有利于發(fā)揮其功能.

3 結(jié)語

文中探討了大分子擁擠體系中蛋白質(zhì)糖基化的有效性，發(fā)現(xiàn)大分子擁擠體系可加速接枝反應(yīng)的進程，大大縮短反應(yīng)時間.電泳圖譜結(jié)果表明，接枝效果良好，所得產(chǎn)物具有優(yōu)異的性能，特別是乳化活性和熱穩(wěn)定性.此外，文中還從構(gòu)象角度揭示了大分子擁擠體系中蛋白質(zhì)糖基化產(chǎn)物的特性:反應(yīng)體系中蛋白二級結(jié)構(gòu)α螺旋含量減少，無規(guī)則卷曲含量增強，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的柔韌性增強，更有利于發(fā)揮其功能.SDC作為一種性能優(yōu)異的的大分子復(fù)合物在食品工業(yè)中有廣泛的應(yīng)用，文中提供的SDC制備方法可為工業(yè)生產(chǎn)提供一定的技術(shù)基礎(chǔ)，有助于SDC的工業(yè)規(guī)模化生產(chǎn).

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