IL－18基因修飾對肺癌細(xì)胞來源exosome誘導(dǎo)殺傷腫瘤細(xì)胞作用的影響*

張?jiān)谠?，李曉梅，王涓冬，孫建華，姜玉華△，潘祥林

(山東大學(xué)第二醫(yī)院1腫瘤防治中心，2血液內(nèi)科，山東 濟(jì)南 250033)

肺癌的發(fā)病率和死亡率高，目前居惡性腫瘤死因的首位。生物免疫治療是肺癌治療的重要手段，exosome疫苗在多種腫瘤中顯示了抗腫瘤作用，受到普遍關(guān)注，但eoxosme疫苗的療效有待于進(jìn)一步提高。白細(xì)胞介素18(interleukin 18，IL-18)具有強(qiáng)大的免疫刺激功能，IL－18基因修飾能增強(qiáng)腫瘤疫苗的療效[1]，但I(xiàn)L－18基因修飾否能增強(qiáng)肺癌細(xì)胞來源exosome誘導(dǎo)的抗腫瘤作用尚不清楚。腫瘤細(xì)胞來源的exosome含有腫瘤抗原，能夠刺激樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC)誘導(dǎo)活化T細(xì)胞而產(chǎn)生抗腫瘤作用[2]，是exosome疫苗重要來源。為此，本文旨在研究IL－18基因修飾的NCI-H460肺癌細(xì)胞來源exosome誘導(dǎo)活化T細(xì)胞對肺癌細(xì)胞的殺傷作用，為獲得高效的exosome疫苗作初步探討。

材料和方法

1 主要材料及儀器

RPMI-1640培養(yǎng)液 (Gibco);蔗糖、重水(Sigma);超濾離心管(Millipore);鼠抗人熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)、人白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigtn，HLA)及 IL-18 抗體(Santa Cruz);辣根酶標(biāo)記兔抗鼠 IgG(Santa Cruz);ECL(Santa Cruz);LDH試劑盒(南京建成生物工程公司);IL-18和pcDNA3.1+載體修飾的NCI-H460細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。CO2培養(yǎng)箱(Format);超速冷凍離心機(jī)(55P-72型，日立)，TEM-100X透射電鏡(日立);電泳儀及凝膠成像儀(Bio-Rad);紫外分光光度儀(Hewlett-Packard)。

2 Exosome的提取及電鏡觀察

將IL-18基因修飾的NCI-H460細(xì)胞(IL-18/H460)、pcDNA3.1+載體修飾細(xì)胞(DNA3.1/H460)及未修飾NCI-H460細(xì)胞(NCI-H460)用RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，收集上清液，用差速離心法提取exosome。細(xì)胞培養(yǎng)上清液1000×g，離心10 min;取上清，10000×g離心10 min;取上清液，將30%蔗糖/重水墊、上清液及PBS依次放入離心管中，100000×g，離心1 h;取混有exosome的蔗糖/重水墊，用PBS懸浮，加入到100 kD超濾離心管中，重復(fù)3次，濃縮液即為exosome，用0.22 μm的濾膜過濾除菌，放入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

取exosome 20 μL，滴于載樣銅網(wǎng)上，室溫靜置1 min，用濾紙吸干液體，滴加20 g/L磷鎢酸負(fù)染1 min，用濾紙吸干負(fù)染液，用白熾燈烤干，透射電鏡下觀察形態(tài)。

3 Exosome蛋白分析

將exosome經(jīng)超聲沖擊破膜，用Western blotting方法檢測exosome中HSP70、HLA及IL-18的表達(dá)。取20 μg用SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，室溫封閉1h，加入鼠抗人 HSP70、HLA、IL-18抗體，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠IgG抗體，進(jìn)行ECL反應(yīng)顯影，在Bio-Rad凝膠成像儀中觀察分析結(jié)果。

4 Exosome誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞對肺癌細(xì)胞的殺傷作用

分離人外周血T細(xì)胞，在T細(xì)胞中加入10 μg exosome培養(yǎng)72 h，為exosome直接刺激活化的T細(xì)胞。用人外周血單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)DC[3]，將成熟DC加入exosome 10 μg培養(yǎng)24 h，再將DC與T細(xì)胞按1∶10混合培養(yǎng)72 h，為exosome沖擊DC活化的T細(xì)胞。以活化T細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞(E)，NCI-H460細(xì)胞為靶細(xì)胞(T)，設(shè)反應(yīng)孔、最大釋放孔及自然釋放孔，反應(yīng)孔含效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞，自然釋放孔只加靶細(xì)胞，最大釋放孔加Triton X-1002 μL，按乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒說明書用LDH 法測定效靶比分別為 25∶1、10∶1、5∶1 時(shí)活化 T細(xì)胞對NCI-H460細(xì)胞的殺傷作用，計(jì)算殺傷率。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 Exosome的電鏡觀察及蛋白分析

3組細(xì)胞上清液經(jīng)差速離心法提取exosome，透射電鏡下觀察到exosome呈囊泡狀，圓球形，大小不一，直徑在30-150 nm之間，3組exosome的形態(tài)、大小無顯著差異。用Western blotting方法檢測exosome中HSP70、HLA及IL-18的表達(dá)，結(jié)果3組細(xì)胞exosome均有HSP70及HLA蛋白表達(dá)。IL-18/H460組exosome有IL-18蛋白的表達(dá)，而其余2組未見IL-18蛋白表達(dá)，見圖1。

Figure1.HSP70，HLA and IL-18 proteins in exosomes of the 3 groups(IL-18/H460，DNA3.1/H460，and NCIH460)were detected by Western blotting.HSP70 and HLA proteins were detected in exosomes of all the 3 groups，and IL-18 protein was observed only in IL-18/H460 group.圖1 Exosome中HSP70、HLA及IL－18蛋白表達(dá)

2 Exosome刺激的T細(xì)胞對NCI－H460細(xì)胞的殺傷作用

用3組細(xì)胞exosome直接刺激T細(xì)胞，用LDH法檢測T細(xì)胞對NCI-H460細(xì)胞的殺傷作用。結(jié)果在效靶比25∶1、10∶1、5∶1 時(shí)，IL-18/H460 組殺傷率為(38.45±5.42)%、(25.17±3.94)%和(11.75±3.22)%，效靶比25∶1和10∶1時(shí)高于DNA3.1/H460組(P＜0.05)及NCI-H460組(P＜0.05)，后2組之間殺傷率無顯著差異。IL-18/H460組殺傷率隨效應(yīng)細(xì)胞比例增加而提高，效靶比25∶1時(shí)殺傷率高于10∶1(P ＜0.05)及5∶1時(shí)(P ＜0.05)，見圖2。

3 Exosome沖擊DC活化的T細(xì)胞對NCI－H460細(xì)胞的殺傷作用

將3組細(xì)胞exosome沖擊DC，再用DC活化T細(xì)胞，檢測其對NCI-H460細(xì)胞的殺傷作用。在效靶比25∶1、10∶1、5∶1 時(shí) IL-18/H460 組殺傷率為(89.05±4.06)%、(64.97±6.02)%和(40.16±4.98)%，均高于DNA3.1/H460組(P＜0.05)及NCI-H460組(P＜0.05)，后2組之間無顯著差異。IL-18/H460組效靶比25∶1時(shí)殺傷作用最強(qiáng)，10∶1時(shí)次之，5∶1 時(shí)作用最弱，見圖3。

Figure2.The lethal effects of exosome-activated T cells on NCI-H460 lung cancer cells(LDH method).The killing rates of IL-18/H460 group at E∶T ratio of 25∶1，10∶1 and 5∶1 were higher than those in DNA3.1/H460 and NCI-H460 groups..n=6.△P ＜0.05 vs IL-18/H460.E∶T =effector cell∶target cell.圖2 Exosome刺激的T細(xì)胞對NCI－H460細(xì)胞的殺傷作用

Figure3.The lethal effects of exosome-pulsed DC-activated T cells on NCI-H460 lung cancer cells(LDH method).The killing rates of IL-18/H460 group at E∶T ratio of 25∶1，10∶1 and 5∶1 were higher than those in DNA3.1/H460 and NCI-H460 groups..n=6.△P ＜0.05 vs IL-18/H460.圖3 Exosome沖擊DC活化的T細(xì)胞對NCI－H460細(xì)胞的殺傷作用

4 Exosome沖擊DC活化的T細(xì)胞與exosome直接刺激的T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞作用比較

將exosome沖擊DC活化的T細(xì)胞殺傷作用與exosome直接刺激T細(xì)胞的殺傷作用相比較，前者在效靶比25∶1、10∶1、5∶1 時(shí)其 IL-18/H460 組殺傷率均高于后者(P＜0.05)，表明用IL－18基因修飾的NCI-H460細(xì)胞來源的exosome誘導(dǎo)抗腫瘤作用時(shí)，exosome沖擊DC活化的T細(xì)胞殺傷作用強(qiáng)于exosome直接刺激活化的T細(xì)胞，見圖4。

Figure4.Comparison of the anti-tumor efficacy between exosome-pulsed DC-activated T cells and exosomestimulated T cells in IL-18/H460 group.The killing rates of exosome-pulsed DC-activated T cells at E∶T ratio of 25∶1，10∶1 and 5∶1 were higher than those of exosome-stimulated T cells..n=6.△P＜0.05 vsexosome-DC.圖4 Exosome沖擊DC活化的T細(xì)胞與exosome直接刺激的T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞作用比較

討 論

Exosome最初用來描述網(wǎng)織紅細(xì)胞分泌的一種膜小泡，后來發(fā)現(xiàn)B淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等多種細(xì)胞可分泌exosome[4，5]，它來源于細(xì)胞的多泡體，是由多泡體的泡膜與質(zhì)膜融合后釋放到胞外空間的小泡，由脂質(zhì)雙分子層膜包被，直徑為30-100 nm，呈蝶形或球形。Exosome含有豐富的蛋白質(zhì)，不同細(xì)胞來源的exosome所含的蛋白質(zhì)不同，其生物學(xué)功能也有差異。腫瘤細(xì)胞來源的exosome含有MHC-Ⅰ類分子、熱休克蛋白、腫瘤特異性抗原及腫瘤共同抗原，可以作為一種抗原載體，將腫瘤抗原轉(zhuǎn)移到抗原提呈細(xì)胞，并具有交叉提呈作用[6]。殺傷性T細(xì)胞是抗腫瘤免疫治療的關(guān)鍵細(xì)胞，T細(xì)胞的活化需要有腫瘤抗原，抗原呈遞、共刺激分子等，exosome含腫瘤抗原和抗原呈遞所需物質(zhì)，本身可以呈遞抗原，活化T細(xì)胞，因而是exosome腫瘤疫苗的重要來源。應(yīng)用腫瘤細(xì)胞來源的exosome構(gòu)建腫瘤疫苗，可以通過exosome沖擊DC而誘導(dǎo)活化T細(xì)胞，也可由exosome直接刺激活化T細(xì)胞，發(fā)揮抗腫瘤作用[7，8]。本研究比較了NCI-H460細(xì)胞來源的exosome經(jīng)沖擊DC后活化T細(xì)胞與直接刺激活化T細(xì)胞對肺癌細(xì)胞的殺傷作用，結(jié)果exosome直接刺激活化的T細(xì)胞顯示了對肺癌細(xì)胞的殺傷作用，但殺傷效力較exosome沖擊DC后活化的T細(xì)胞明顯減弱，表明了DC在exosome腫瘤疫苗中的關(guān)鍵地位。

目前的exosome疫苗雖然顯示了一定的抗腫瘤作用，但其效力有待于增強(qiáng)。IL-18是功能強(qiáng)大的細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)TNF-α、GM-CSF和 IFN-γ等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和DC的活性，在抗腫瘤和機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)等方面具有重要作用[9]，研究顯示IL－18基因修飾能夠增強(qiáng)DC的活性和免疫刺激能力[10]。我們研究了IL－18基因修飾的NCI-H460細(xì)胞來源exosome誘導(dǎo)的T細(xì)胞對肺癌細(xì)胞的殺傷作用，以pcDNA3.1+修飾的NCI-H460細(xì)胞與未修飾的NCI-H460細(xì)胞為對照，結(jié)果IL-18基因修飾組作用明顯強(qiáng)于對照組，而后二者之間作用無顯著差異，因而排除了基因轉(zhuǎn)染過程的干擾因素。這表明IL-18基因修飾可以增強(qiáng)肺癌細(xì)胞來源exosome誘導(dǎo)的抗腫瘤作用，為IL-18與exosome疫苗聯(lián)合用于肺癌治療提供了理論依據(jù)，但其作用機(jī)制尚待進(jìn)一步闡明。

[1]Cao DY，Yang JY，Dou KF，et al.Alpha-fetoprotein and interleukin-18 gene-modified dendritic cells effectively stimulate specific type-1 CD4-and CD8-mediated T-cell response from hepatocellular carcinoma patients in vitro[J].Hum Immunol，2007，68(5):334-341.

[2]張家模，吳小候，張 堯，等.膀胱移行細(xì)胞癌來源的exosome誘導(dǎo)體外細(xì)胞毒性T細(xì)胞殺傷效應(yīng)[J].中華腫瘤雜志，2009，31(10):738-741.

[3]傅永強(qiáng)，張?jiān)谠?，李旭升，?白細(xì)胞介素-18干預(yù)誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞表型和活性研究[J].中國病理生理雜志，2008，24(7):1414-1417.

[4]Viaud S，Théry C，Ploix S，et al.Dendritic cell-derived exosomes for cancer immunotherapy:what's next?[J].Cancer Res，2010，70(4):1281-1285.

[5]Saunderson SC，Schuberth PC，Dunn AC，et al.Induction of exosome release in primary B cells stimulated via CD40 and the IL-4 receptor[J].J Immunol，2008，180(12):8146-8152.

[6]Clayton A，Mitchell JP，Court J，et al.Human tumorderived exosomes down-modulate NKG2D expression[J].J Immunol，2008，180(11):7249-7258.

[7]Hao S，Bai O，Li F，et al.Mature dendritic cells pulsed with exosomes stimulate efficient cytotoxic T-lymphocyte responses and antitumour immunity[J].Immunology，2007，120(1):90-102.

[8]Tan A，De La Pe?a H，Seifalian AM.The application of exosomes as a nanoscale cancer vaccine[J].Int J Nanomedicine，2010，5:889-900.

[9]Nakanishi K，Tsutsui H，Yoshimoto T.Importance of IL-18-induced super Th1 cells for the development of allergic inflammation[J].Allergol Int，2010，59(2):137-141.

[10]張?jiān)谠?，吳金?白細(xì)胞介素18基因轉(zhuǎn)染的肺癌細(xì)胞對樹突狀細(xì)胞免疫特性的影響[J].中國病理生理雜志，2007，23(4):794-798.