蛋白酶體抑制劑MG132對腦室室管膜下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖潛能的影響*

趙云鶴，張衛(wèi)國，朱 茜，楊桂姣，陸 利

(山西醫(yī)科大學(xué)人體解剖學(xué)教研室，山西 太原 030001)

神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的原始細(xì)胞，具有自我更新和多向分化潛能[1]。NSCs不僅存在于發(fā)育中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而且還富集于成年哺乳動物側(cè)腦室室管膜下區(qū)(subventricular zone，SVZ)、海馬齒狀回(dentate gyrus，DG)、嗅球等腦區(qū)[2]。有報(bào)道證實(shí)，隨年齡增加，體內(nèi)NSCs增殖能力下降、數(shù)量減少，而且這種由于機(jī)體內(nèi)環(huán)境失衡所致的干細(xì)胞庫耗竭是多種老年性疾病的共同病因[3]，其潛在的機(jī)制亟待闡明。蛋白酶體是新近受到關(guān)注的蛋白水解酶復(fù)合體，它通過選擇性降解泛素化的靶蛋白參與維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，介導(dǎo)細(xì)胞多種生命活動過程。有關(guān)蛋白酶體功能活性與NSCs增殖能力的相關(guān)研究尚未見報(bào)道。為此，本研究擬應(yīng)用蛋白酶體抑制劑MG132注射入成年小鼠側(cè)腦室，通過5－溴－2'－脫氧尿嘧啶核苷(5－bromo－2'－deoxyuridine，BrdU)摻入實(shí)驗(yàn)動態(tài)觀察蛋白酶體活性改變對NSCs增殖能力的影響，為神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機(jī)制研究提供新思路。

材料和方法

1 材料

清潔級BALB/c小鼠，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。蛋白酶體抑制劑MG132購自碧云天生物技術(shù)研究所，蛋白酶體活性檢測試劑盒為Millipore產(chǎn)品，BrdU購自Sigma，山羊血清封閉液購自博士德生物工程有限公司，BrdUⅠ抗購自Millipore，山羊抗鼠CY3熒光Ⅱ抗購自Sigma，DAPI熒光封片劑為Vector產(chǎn)品。

2 方法

2.1 動物分組 選擇90日齡、體重(20±2)g、清潔級BALB/c小鼠60只，雌雄各半，隨機(jī)分為6組(實(shí)驗(yàn)組3 d、7 d、14 d 組和對照組3 d、7 d、14 d 組)，每組10只。實(shí)驗(yàn)組側(cè)腦室注射蛋白酶體抑制劑MG132(10 g/L，DMSO稀釋)，對照組注射等體積DMSO。側(cè)腦室注射3 d、7 d、14 d后每組5只小鼠提取SVZ總蛋白，檢測蛋白酶體活性;另5只小鼠進(jìn)行BrdU腹腔注射標(biāo)記NSCs，免疫熒光染色，檢測SVZ BrdU+NSCs數(shù)量。

2.2 蛋白酶體抑制劑MG132側(cè)腦室定位注射 小鼠以3%水合氯醛(40 mg/kg)腹腔麻醉后，固定于江灣I型腦立體定位儀，手術(shù)區(qū)備皮、消毒，正中線切開皮膚，暴露前囟，參照小鼠腦立體定位圖譜[4]于前囟前0.67 mm，左側(cè)旁開0.6 mm，垂直進(jìn)針，進(jìn)針深度2.2 mm。將 1 μL MG132(10 g/L)，緩慢注入側(cè)腦室，注射完畢留針5 min再緩慢退出，縫合頭皮，術(shù)后保溫飼養(yǎng)。另設(shè)DMSO溶劑對照組，左側(cè)側(cè)腦室注射 1 μL DMSO。

2.3 蛋白酶體活性檢測 提取SVZ總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，將30 μg總蛋白加入蛋白酶體活性檢測反應(yīng)體系，37℃孵育2 h，SPECTRAMax－M2e熒光酶標(biāo)儀380 nm(激發(fā)光)/460 nm(發(fā)射光)處測定熒光強(qiáng)度。計(jì)算實(shí)驗(yàn)組和對照組熒光強(qiáng)度比值，統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2.4 BrdU腹腔注射標(biāo)記NSCs 配制BrdU(6 g/L)溶液，按30 mg/kg給予小鼠腹腔注射，每隔2 h注射1次，共注射6次。于末次注射24 h后灌注取材，Leica恒冷箱切片機(jī)進(jìn)行連續(xù)冠狀切片，片厚16 μm，收集兩側(cè)胼胝體連接起始處至前連合連接部位(前囟+1.10 mm至前囟+0.14 mm)的所有腦片。

2.5 免疫熒光染色 腦片丙酮浸沒，2 mol/L HCl 37℃水浴孵育17 min打開DNA雙鏈;BrdUⅠ抗4℃孵育過夜;熒光Ⅱ抗37℃孵育2 h;DAPI封片液封片，Olympus熒光顯微鏡下觀察、攝片，計(jì)數(shù)各組胼胝體連接起始處至前連合連接部位所有腦片SVZ BrdU+NSCs數(shù)量，統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，多組間的比較采用One－way ANOVA方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1 BrdU免疫熒光染色

BrdU腹腔注射24 h，免疫熒光染色可見BrdU+NSCs分布于側(cè)腦室SVZ，陽性細(xì)胞密集排列于側(cè)腦室背外側(cè)區(qū)，見圖1A－a。BrdU+著色部位為細(xì)胞核，形態(tài)為圓形或橢圓形，可與細(xì)胞核特異性熒光染料DAPI，見圖1A－b;重疊呈現(xiàn)粉紅色，見圖1A－c。MG132注射側(cè)和對側(cè)BrdU+NSCs數(shù)量無顯著差別(P ＞0.05)，見圖1B。

Figure1.Immunofluorescent staining of BrdU in SVZ.A:the distribution of BrdU+cells around the lateral ventricle，bar=100 μm(a)，bar=25 μm(b，c);B:quantification of the number of BrdU+cells.圖1 腦室室管膜下區(qū)BrdU免疫熒光染色

2 MG132注射后不同時(shí)點(diǎn)SVZ蛋白酶體活性

側(cè)腦室注射MG1323 d、7 d、14 d后提取SVZ總蛋白，熒光酶標(biāo)儀檢測蛋白酶體活性，見圖2。結(jié)果顯示MG132注射3 d、7 d組SVZ蛋白酶體活性較DMSO對照組顯著降低，分別降至0.662±0.100(P＜0.05)和0.687±0.105(P＜0.05)，提示側(cè)腦室注射MG132短時(shí)程內(nèi)(3 d、7 d)能夠有效抑制SVZ蛋白酶體活性。MG132注射14 d后SVZ蛋白酶體活性較3 d、7 d顯著增高(P＜0.05)，與DMSO對照組相比無明顯差異(P＞0.05)，提示可逆性蛋白酶體抑制劑MG132側(cè)腦室注射14 d后其抑制作用消失，SVZ蛋白酶體活性恢復(fù)至正常水平。

Figure2.Fold of proteasome activity after injection of MG132 or DMSO.*P ＜ 0.05 vs DMSO in the same time point;△P ＜0.05 vs 14 d.圖2 MG132組和DMSO組注射后不同時(shí)點(diǎn)蛋白酶體活性變化

3 MG132注射后不同時(shí)點(diǎn)SVZ BrdU+細(xì)胞數(shù)

側(cè)腦室注射MG1323 d、7 d后，SVZ BrdU+NSCs降至21±4(圖3D')和22±3(圖3E)，較 DMSO 對照組[67±8(圖3A)和53±6(圖3B)]明顯減少(圖4)，P＜0.05，提示降低SVZ蛋白酶體活性能夠顯著抑制NSCs增殖能力。側(cè)腦室注射MG13214d后隨SVZ蛋白酶體活性恢復(fù)BrdU+NSCs數(shù)量升至82±4(圖3F)，與DMSO對照組相比(67±6)(圖3C)無顯著差異(圖4)，P＞0.05，提示隨時(shí)間延長可逆性蛋白酶體抑制劑MG132抑制作用消除，NSCs增殖能力恢復(fù)至正常水平。

討 論

NSCs是具有自我更新能力和多向分化潛能的未分化細(xì)胞。位于SVZ的NSCs是目前公認(rèn)的成年個(gè)體NSCs最為集中的地方，分裂增殖產(chǎn)生的祖細(xì)胞可以長距離遷移至嗅球，是研究個(gè)體發(fā)育過程中NSCs生物學(xué)特性的最佳部位[5，6]。因此，本實(shí)驗(yàn)選取SVZ作為目的腦區(qū)，通過 BrdU摻入實(shí)驗(yàn)觀察NSCs增殖情況。BrdU是研究在體NSCs增殖和分化能力的一種確切可靠的標(biāo)記方法，目前已被國際上廣泛應(yīng)用[7，8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示BrdU陽性NSCs分布于側(cè)腦室SVZ，BrdU陽性細(xì)胞著色部位為細(xì)胞核，可與細(xì)胞核特異性熒光染料DAPI重疊，證明染色結(jié)果特異性強(qiáng)，BrdU免疫熒光標(biāo)記能夠客觀反映NSCs增殖情況。

Figure3.Immunofluorescent staining of BrdU in SVZ after injection of MG132 or DMSO at different time points.A:3 d DMSO group;B:7 d DMSO group;C:14 d DMSO group;D:3 d MG132 group;E:7 d MG132 group;F:14 d MG132 group.Bar=50 μm.圖3 MG132組和DMSO組注射后不同時(shí)點(diǎn)腦室室管膜下區(qū)BrdU免疫熒光表達(dá)

Figure4.Quantification of the number of BrdU+cells after injection of MG132 or DMSO at different time points.*P＜0.05 vs DMSO at the same time point;△P ＜0.05 vs 14 d.圖4 MG132組和DMSO組注射后不同時(shí)點(diǎn)BrdU陽性細(xì)胞數(shù)

蛋白酶體是一種高度保守的多價(jià)催化蛋白酶復(fù)合物，通過選擇性降解功能蛋白，介導(dǎo)DNA修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生命活動[9]。應(yīng)用蛋白酶體抑制劑改變蛋白酶體活性是目前研究蛋白酶體功能的重要手段。MG132是經(jīng)典的蛋白酶體抑制劑，屬醛基肽類蛋白酶體抑制劑，它通過與蛋白酶體催化中心可逆性結(jié)合，抑制蛋白酶體活性，從而阻斷其對異常蛋白的降解。本實(shí)驗(yàn)選擇側(cè)腦室注射10 μg MG132，結(jié)果顯示側(cè)腦室注射MG1323 d、7 d后能夠顯著抑制SVZ蛋白酶體活性，但隨注射時(shí)間延長，14 d后SVZ蛋白酶體活性恢復(fù)至正常水平，與DMSO對照組相比無明顯差別，表明側(cè)腦室注射MG132能夠可逆性調(diào)節(jié)SVZ蛋白酶體活性。

近年的研究結(jié)果表明隨年齡增加體內(nèi)蛋白酶體活性持續(xù)降低[10]。Hwang 等[11]的研究結(jié)果顯示，50歲人群蛋白酶體活性僅為20歲人群的1/2，高齡人群蛋白酶體功能亞單位合成顯著減少。蛋白酶體功能異常將會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化蛋白和泛素化蛋白堆積，這些結(jié)構(gòu)和功能異常的蛋白產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用從而引發(fā)細(xì)胞損傷。Chondrogianni等[12]應(yīng)用蛋白酶體抑制劑作用于表皮成纖維細(xì)胞，細(xì)胞出現(xiàn)增殖能力降低、生長停滯以及凋亡跡象，細(xì)胞周期抑制因子p21、p16表達(dá)水平上調(diào)。若過表達(dá)蛋白酶體相關(guān)基因、改善蛋白酶體活性，則能增強(qiáng)細(xì)胞對氧化損傷的耐受力，提高細(xì)胞存活率[13]。本研究結(jié)果也證實(shí)，側(cè)腦室注射MG1323 d、7 d后蛋白酶體活性下降，SVZ BrdU+NSCs數(shù)量顯著減少;14 d后隨蛋白酶體活性恢復(fù)，BrdU+NSCs數(shù)量升至正常水平，表明蛋白酶體活性與NSCs增殖能力密切相關(guān)。干細(xì)胞的自我更新、激活、增殖、分化依賴于其生存的特殊微環(huán)境，即干細(xì)胞niche。有文獻(xiàn)報(bào)道蛋白酶體功能缺陷是帕金森、老年癡呆等神經(jīng)退行性疾病的共同病因[14，15]。由此我們推測，蛋白酶體活性降低造成錯誤蛋白和氧化蛋白在體內(nèi)蓄積[16]，破壞NSCs生存微環(huán)境，進(jìn)而導(dǎo)致個(gè)體神經(jīng)發(fā)育及再生障礙。然而，NSCs的增殖分化受多種信號通路調(diào)控，其過程錯綜復(fù)雜，蛋白酶體對NSCs增殖能力的調(diào)控機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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