hPer3基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)在慢性粒細(xì)胞白血病急變監(jiān)測(cè)中的臨床意義*

李翊衛(wèi)， 王曄愷， 周吉航， 周世權(quán)， 方國(guó)安， 劉曉光

(舟山醫(yī)院1檢驗(yàn)科，2細(xì)胞分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，浙江 舟山 316004)

慢性粒細(xì)胞性白血病(chronic myelocytic leukemia，CML)是一種起源于骨髓多能干細(xì)胞的惡性增殖性疾病，起病隱匿，一旦急變，治療困難，死亡率高［1，2］。因此，對(duì) CML 急變的早期監(jiān)測(cè)尤為重要。時(shí)鐘基因在宏觀上能作用于前下丘腦視上核影響生物鐘變化［3］，在微觀上對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的增殖分化存在密切影響［4，5］。但時(shí)鐘基因與白血病的報(bào)道不多，我們通過觀察CML急變中時(shí)鐘基因hPer3(human period 3)的表達(dá)和啟動(dòng)子甲基化水平變化，并將hPer3基因轉(zhuǎn)染CML細(xì)胞株K562觀察對(duì)其的抑制和促凋亡作用，以明確hPer3基因在CML急變中的作用及檢測(cè)價(jià)值。

材料和方法

1 臨床資料

收集我院2006年1月－2010年11月門診和住院CML患者骨穿標(biāo)本29例，抽取時(shí)間均為上午8:00 －10:00，瑞氏染色法鏡檢確定 FAB 分型［6］，CML慢性期17例，男10例，女7例，中位年齡43(39－57)歲，CML加速期6例，男4例，女2例，中位年齡46(37－53)歲，CML急變期6例，男5例，女1例，中位年齡49(37－62)歲，以良性血液病組40例(均為缺鐵性貧血)為對(duì)照，樣本抽取時(shí)間同上，男21例，女19例，中位年齡37(18－62)歲，良性血液病組骨穿檢查均符合臨床指征，采用肝素抗凝針筒留取2－4 mL骨髓，－80℃冰箱保存。

2 儀器和試劑

DNA純化試劑盒和普通PCR擴(kuò)增試劑盒購自Promega，對(duì)苯二酚、亞硫酸氫鈉、氯仿、氫氧化鈉購自上海晶純?cè)噭┯邢薰荆珼NA marker購自廣州東盛生物科技有限公司，Trizol購自Invitrogen，CpG甲基轉(zhuǎn)移酶(CpG methyltransferase，M.SssI)購自北京NEB，pMD18載體試劑盒和熒光定量 PCR試劑盒(SYBR Green I)購自TaKaRa，小牛血清和 RPMI－1640培養(yǎng)液購自碧云天，K562細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞庫。甲基化特異性－PCR引物:MSF正義鏈5'－ CGGGAGTTTTGGGTATTCGC － 3'，反義鏈 5'－CGACCCGACTAACTAAAACG－3'，甲基化產(chǎn)物 182 bp;USF正義鏈5'－TGGGTGGTTGGGTGGGAGTTTTGGGTATTTGT －3'，反義鏈 5'－AATCCAACACCAACAACCCAACTAACT AAAACA －3'，非甲基化產(chǎn)物207 bp;熒光定量 PCR引物:hPer3正義鏈 5'－ACAAACAGAACCACAAGGCA －3'，反義 鏈 5'－CGTCCATTTGTTGGCATTT －3'，擴(kuò)增產(chǎn)物 94 bp;GAPDH正義鏈 5'－GACCTGACCTGCCGTCTA －3'，反義鏈 5'－ AGGAGTGGGTGTCGCTGT－3'，擴(kuò)增產(chǎn)物148 bp;pcDNA3.1 －h(huán)Per3 PCR 引物:pcDNA3.1－h(huán)Per3正義鏈5'－CTTGGTACCGAGCTCGGATCCATGC CCCGCGGG-GAAGCTCC －3'，反義鏈 5'－CGGGCCCTCTAGACTC-GAGTTACG TTCGAACTTTATGCC－3';均由上海生工合成。hPer3質(zhì)粒模板由舟山同生生物科技有限公司協(xié)助構(gòu)建。凝膠成像系統(tǒng)為Bio－Rad公司Universal Hood II型，凝膠成像分析軟件為Quantity One，普通 PCR 儀為 Roche Mycycle，熒光PCR儀為Roche Lightcycle。

3 方法

3.1 生物信息學(xué)分析 從MethDB數(shù)據(jù)庫中選取hPer3啟動(dòng)子中富含CpG島的－465～269位點(diǎn)區(qū)域利用ABI MethPrimer軟件設(shè)計(jì)甲基化引物:MSF正義鏈(－453～444)，反義鏈(－281～301);非甲基化引物:USF正義鏈(－465～444)，反義鏈(－269～301)。

3.2 hPer3 mRNA 檢測(cè)

3.3 hPer3基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)

為加強(qiáng)日常的運(yùn)行與管理，保證工程的良性運(yùn)行，避免因職能設(shè)置混亂、相互扯皮及人員分工的不合理造成不應(yīng)有的經(jīng)濟(jì)損失而影響日常的正常通水要求，應(yīng)建立健全各項(xiàng)規(guī)章制度、完善職能分工和搞好人員的優(yōu)化配置。

①hPer3和GAPDH標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建 用Trizol提取骨髓總RNA，鑒定完整性和純度，取5 μg總RNA冰上逆轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR，反應(yīng)體系25 μL:其中 DNA 模板 2 μL，10 μmol/L hPer3 或 GAPDH 熒光定量 PCR 引物各1 μL，5 ×PCR 緩沖液5 μL，加去RNA酶水補(bǔ)至25 μL，反應(yīng)條件:95℃ 10 min;95℃20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)純化后，加入連接緩沖液5 μL、純化的目的片段4.5 μL、pMD18 －T 載體 0.5 μL，低速離心后于16℃連接過夜，將連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后涂氨芐青霉素平板，挑取單菌落培養(yǎng)過夜，抽提其質(zhì)粒通過PCR鑒定陽性重組子，送上海生工公司測(cè)序確認(rèn)。

②實(shí)時(shí)熒光定量PCR 將重組質(zhì)粒倍比梯度稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)品，用①中的cDNA進(jìn)行SYBR Green I熒光染料嵌合法檢測(cè)，反應(yīng)體系參照試劑說明書，反應(yīng)條件:95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min，利用各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別對(duì)樣品中目的基因和內(nèi)參照基因分別進(jìn)行定量，骨髓組織或白血病細(xì)胞株中hPer3基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量為hPer3基因拷貝數(shù)/GAPDH基因拷貝數(shù)。

歸一化的效果是將原始數(shù)據(jù)映射到[0,1]區(qū)間,之后用訓(xùn)練集對(duì)SVM進(jìn)行訓(xùn)練,最后用得到的模型來預(yù)測(cè)測(cè)試集分類標(biāo)簽.本文中選取能較好反映5種狀態(tài)的18名被試的總共300組典型數(shù)據(jù)作為訓(xùn)練集,再選取另外的200組數(shù)據(jù)作為測(cè)試集.設(shè)置5種交互狀態(tài)下類別標(biāo)簽分別為(0;1;2;3;4).

③結(jié)果判定 甲基化引物進(jìn)行擴(kuò)增有產(chǎn)物而非甲基化擴(kuò)增無產(chǎn)物為完全甲基化，甲基化引物和非甲基化擴(kuò)增都有產(chǎn)物為部分甲基化，甲基化引物進(jìn)行擴(kuò)增無產(chǎn)物而非甲基化擴(kuò)增有產(chǎn)物為無甲基化。完全和部分甲基化判定為甲基化陽性，無甲基化為甲基化陰性。

①“村兩委”成立公共衛(wèi)生委員會(huì)，加強(qiáng)對(duì)村民“綠色生活”教育，提高村民環(huán)保意識(shí)。加強(qiáng)農(nóng)村環(huán)境衛(wèi)生綜合治理，制定衛(wèi)生公約，定期開展衛(wèi)生檢查和評(píng)定。對(duì)污染嚴(yán)重的鄉(xiāng)村企業(yè)，由鄉(xiāng)（鎮(zhèn)）政府下達(dá)限期整改、取締或關(guān)閉的通知。

②甲基化特異性PCR 以ddH2O為空白對(duì)照，用經(jīng)M.SssI處理后的基因組DNA為陽性對(duì)照。反應(yīng)體系25 μL，其中 DNA 模板 2 μL，10μmol/L 甲基化或非甲基化正反向引物各1 μL，5×PCR 緩沖液5 μL，加去離子水補(bǔ)至25 μL。95℃預(yù)變性15 min;94℃50 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，35 個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min，完成擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)物用2%的瓊脂糖電泳，凝膠成像儀紫外燈下觀察結(jié)果。

①組織DNA抽提和甲基化修飾 采用苯酚氯仿法抽提患者骨髓基因組DNA和細(xì)胞株基因組DNA，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)量測(cè)定吸光度，確定其純度。吸取4 μL基因組DNA至40 μL去離子水中，加10 μL 3 mol/L的氫氧化鈉，37℃孵育20 min，加入30 μL 10 mmol/L 的對(duì)苯二酚和520 μL 1.5 mol/L 的亞硫酸氫鈉，50℃孵育16 h，應(yīng)用DNA純化試劑盒純化回收，加入50 μL 1 mol/L的氫氧化鈉，室溫放置5 min終止修飾，無水乙醇沉淀離心回收，室溫干燥后加入20 μL去RNA酶水重懸，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

十幾年后，在一個(gè)陰霾的秋日里，我跟一位司機(jī)開大卡車去給一個(gè)鎮(zhèn)子拉活兒。那是一個(gè)彌望郁然、有山有水的鎮(zhèn)子，鎮(zhèn)子被一層薄薄的流霧纏繞著。

③MTT檢測(cè)K562細(xì)胞抑制率 收集②中細(xì)胞，各孔吸出培養(yǎng)液，PBS洗1次，吸棄，加培養(yǎng)液180 μL，實(shí)驗(yàn)終止前加5 g/L MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h;控干液體，每孔加DMSO 150 μL，96孔振蕩板低速混勻10 min。酶標(biāo)儀選擇波長(zhǎng)490 nm，測(cè)定各組各孔吸光度A值。生長(zhǎng)抑制率(IR)計(jì)算公式:IR(%)=(1－實(shí)驗(yàn)組平均A值/對(duì)照組平均A值)×100%。

①pcDNA3.1－h(huán)Per3質(zhì)粒構(gòu)建 hPer3質(zhì)粒模板PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后，重組克隆到pcDNA3.1質(zhì)粒，并對(duì)pcDNA3.1－h(huán)Per3質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)。

②脂質(zhì)體介導(dǎo)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1－h(huán)Per3質(zhì)粒參照試劑盒說明書經(jīng)LipofectamineTM試劑盒轉(zhuǎn)染到K562細(xì)胞，設(shè)空載pcDNA3.1轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組。轉(zhuǎn)染后分別培養(yǎng) 24 h、48 h、72 h、96 h，每組設(shè) 6 復(fù)孔。

3.4 hPer3轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞株

④Annexin V－FITC/PI雙染檢測(cè)凋亡 收集②中細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌棄上清，殘?jiān)?xì)胞收集至流式管。每管加10 μL Annexin V －FITC 和5 μL PI，避光靜置15 min，加300 μL預(yù)冷的PBS，振蕩混勻上機(jī)檢測(cè)其凋亡率。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3.2.3 嚴(yán)格執(zhí)行消毒隔離 ①做好自我防護(hù):戴手套操作;有創(chuàng)治療時(shí)戴護(hù)目鏡;嚴(yán)格執(zhí)行六步洗手法。②做好銳器傷防范:注射車上放置剪刀并固定，以便在床旁及時(shí)處理一次性醫(yī)療廢棄物;醫(yī)師、護(hù)士、保潔工熟知銳器傷后的處理和上報(bào)流程;推廣使用安全型留置靜脈注射器，保護(hù)患者靜脈、保證患者休息、減少銳器傷的發(fā)生。③所有操作嚴(yán)格均按標(biāo)準(zhǔn)預(yù)防技術(shù)操作原則進(jìn)行。④教會(huì)患者家屬處理污物的方法，如接觸疑為血液、體液污染物品需戴手套給予處理并及時(shí)洗手，所有被體液污染物品按醫(yī)療廢棄物處理，防止發(fā)生院內(nèi)外交叉感染的可能。

采用SPSS 13.0軟件，對(duì) hPer3在 CML各階段和對(duì)照組的甲基化分布兩兩進(jìn)行χ2檢驗(yàn)(對(duì)1≤T＜5且n≥40采用校正χ2檢驗(yàn))，對(duì)CML各階段hPer3 mRNA表達(dá)做單因素方差分析和LSD－t檢驗(yàn)，對(duì)K562轉(zhuǎn)染后固定時(shí)點(diǎn)的pcDNA3.1組和pcDNA3.1－h(huán)Per3組抑制率做t檢驗(yàn)，對(duì)K562轉(zhuǎn)染后固定時(shí)點(diǎn)的對(duì)照組和 pcDNA3.1組、pcDNA3.1－h(huán)Per3組做單因素方差分析和LSD－t檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1 hPer3基因啟動(dòng)子在CML各階段的甲基化分布

見圖1，對(duì)照組、CML慢性期、CML加速期和CML急變期中，hPer3啟動(dòng)子甲基化陽性率(例)分別為0%(0/40)、17.65%(3/17)、66.67%(4/6)和83.33%(5/6)。CML急變期和加速期甲基化陽性率均高于 CML慢性期，差異顯著(χ2=8.44，P ＜0.01;χ2=5.03，P ＜0.05)，但與 CML 急變期和加速期差異無顯著(P＞0.05);CML急變期、加速期和慢性期甲基化陽性率均高于對(duì)照組，差異顯著(χ2=29.29，P ＜0.01;χ2=21.41，P ＜0.01;χ2=4.33，P ＜0.05)。

Figure 1.hPer3 promoter methylation rates in IDA group and different phases of CML groups.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs IDA group;▲P ＜0.05，▲▲P＜0.01 vs CML chronic phase group.圖1 hPer3基因啟動(dòng)子在CML各階段和IDA組中的甲基化分布

2 CML各階段hPer3 mRNA表達(dá)

見圖2，對(duì)照組、CML慢性期、CML加速期和CML急變期中hPer3 mRNA表達(dá)為75.03±18.16、5.13±2.29、0.40±0.18和0.17±0.05。各組兩兩之間差異顯著(P＜0.01)。

3 K562細(xì)胞株hPer3啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)

見圖2，K562細(xì)胞株中，hPer3啟動(dòng)子為完全甲基化狀態(tài)，mRNA表達(dá)為0.05±0.03。

Figure 2.hPer3 promoter methylation status in K562 cells.M:methylation;U:unmethylation;m:marker;1:M.SssI;2:K562 cells;3:ddH2O.圖2 K562細(xì)胞中hPer3啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)

4 hPer3轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞株

4.1 MTT檢測(cè)K562細(xì)胞抑制率 見圖3，24 h、48 h、72 h、96 h 各時(shí)點(diǎn)，pcDNA3.1 組抑制率分別為(1.3±0.3)%、(1.6±0.5)%、(1.3±0.5)%、(1.9±0.4)%;pcDNA3.1－h(huán)Per3組抑制率分別為(9.8±2.4)%、(29.1±5.1)%、(48.2±8.1)%、(63.4±10.5)%，各時(shí)點(diǎn)差異顯著(P＜0.01)。

Figure 3.Inhibitory rates of K562 cells detected by MTT.＊＊P ＜0.01 vs pcDNA3.1 group.圖3 MTT檢測(cè)K562細(xì)胞抑制率

4.2 Annexin V－FITC/PI雙染檢測(cè)凋亡 圖4、5結(jié)果顯示，24 h、48 h、72 h、96 h 各時(shí)點(diǎn)，對(duì)照組凋亡率分別為(1.9±0.7)%、(2.6±0.8)%、(2.2±0.6)%、(2.8±0.9)%;pcDNA3.1組凋亡率分別為(2.4±0.8)%、(2.7±1.1)%、(2.5±1.1)%、(3.4±1.3)%;pcDNA3.1－h(huán)Per3組凋亡率分別為(7.4±2.3)%、(11.2±3.7)%、(16.9±4.5)%、(18.8±4.3)%。各時(shí)點(diǎn)pcDNA3.1－h(huán)Per3組凋亡率均高于對(duì)照組和pcDNA3.1組，差異顯著(P＜0.01)。

In this paper,the discriminator of the DLL is defined as:

Figure 4.Apoptotic rates of K562 cells in control group，pcDNA3.1 group and pcDNA3.1 － hPer3 group.＊＊ P ＜0.01 vs pcDNA3.1 group or control group.圖4 各組早期凋亡率

Figure 5.Apoptotic rates of K562 cells detected by AnnexinV/PI staining.圖5 Annexin V－FITC/PI雙染檢測(cè)凋亡

討 論

CML的發(fā)病率僅次于急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)和急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)，慢粒經(jīng)加速期轉(zhuǎn)入急變期過程中，約半數(shù)患者的轉(zhuǎn)變是逐漸發(fā)生的，但也有部分患者轉(zhuǎn)變迅速。國(guó)外有文獻(xiàn)認(rèn)為，CML患者長(zhǎng)期的酪氨酸激酶抑制劑治療引起CML患者骨髓白血病干細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂蓄~外特性的高級(jí)干細(xì)胞，這種高級(jí)干細(xì)胞引發(fā)了CML的急變并產(chǎn)生抗藥等不良后果［1］。CML慢性期出現(xiàn)進(jìn)行性貧血、發(fā)熱持續(xù)不退、脾臟進(jìn)行性腫大、出血傾向和骨骼疼痛、血象及骨髓象的改變等癥狀均預(yù)示有急變的可能。由于CML主要病因?yàn)锽CR－ABL融合基因的產(chǎn)生，對(duì)CML緩解程度的分子生物學(xué)檢測(cè)多以BCR－ABL轉(zhuǎn)錄本水平進(jìn)行判斷。但本研究顯示，hPer3的表達(dá)水平也可能作為慢粒急變的監(jiān)測(cè)指標(biāo)之一，與Yang等［7］的研究結(jié)果基本一致。hPer3作為時(shí)鐘基因的一種，正常體內(nèi)雖存在一定程度的振蕩，但在從CML慢性期進(jìn)入加速期的變化幅度在1個(gè)數(shù)量級(jí)以上，遠(yuǎn)高于正常體內(nèi)的振蕩幅度［8］，可能作為慢粒急變的早期監(jiān)測(cè)指標(biāo)之一。

可見,帶借代意義的詞,之所以獲得了借代意義,從源頭上看,是由于人們?cè)谡J(rèn)知事物的過程中,不同的詞涉及多個(gè)不同角度的關(guān)聯(lián)性所使然。這種不同的角度在語言系統(tǒng)中又是相互依存、相互關(guān)聯(lián)的,沒有主次分別。不過,就其關(guān)聯(lián)的事物的類別而言,同類關(guān)聯(lián)和異類關(guān)聯(lián)還是有著性質(zhì)上的不同。也正因此,我們將這些不同的語義內(nèi)在聯(lián)系方式區(qū)分為同類理據(jù)和異類理據(jù)。從探求理據(jù)的角度看,同類理據(jù)要比異類理據(jù)相對(duì)容易一些。

真核細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)控途徑通常有轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控、翻譯水平的調(diào)控等，啟動(dòng)子區(qū)域甲基化屬于轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的一種，如果CpG島的甲基化為引起轉(zhuǎn)錄效率降低，那么其轉(zhuǎn)錄效率一般和甲基化程度存在相關(guān)性，如Na等［9］用甲基化特異性PCR和逆轉(zhuǎn)錄PCR觀察45例非小細(xì)胞肺癌患者GADD45家族基因啟動(dòng)子甲基化和其 mRNA的關(guān)系，發(fā)現(xiàn) GADD45A、GADD45B和GADD45G 分別有1.4%、7.2%和31.6%的甲基化比率，其中GADD45G mRNA降低與甲基化存在顯著相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，hPer3啟動(dòng)子上的甲基化水平也隨著CML急變而升高，但在急變期和加速期間差異無顯著，可能和樣本例數(shù)過少有關(guān)，并且在慢粒細(xì)胞株K562中也觀察到了hPer3啟動(dòng)子的完全甲基化狀態(tài)。因此CML中很可能是hPer3啟動(dòng)子高甲基化導(dǎo)致了其基因的表達(dá)降低，某些去甲基化制劑5－雜氮－2'－脫氧胞苷誘導(dǎo) MEG－01凋亡［10］可能和恢復(fù)hPer3的表達(dá)有關(guān)。Yang等［7］通過5－雜氮 －2'－脫氧胞苷逆轉(zhuǎn)了K562細(xì)胞中hPer3啟動(dòng)子的高甲基化狀態(tài)并誘導(dǎo)hPer3基因重新表達(dá)，提示抑癌基因hPer3的激活可能是地西他濱治療惡性血液疾病的機(jī)制之一。我們通過轉(zhuǎn)染并在K562細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)hPer3，發(fā)現(xiàn)K562呈現(xiàn)凋亡和生長(zhǎng)抑制。有報(bào)道表明，hPer1參與了ATM－chk1/chk2的DNA損傷反應(yīng)通路，并預(yù)示可能作為一種腫瘤抑制因子［11］，而孫成銘等［12］通過將hPer2轉(zhuǎn)染到K562細(xì)胞中觀察到cyclin B1的降低引起的 G2/M期阻滯［2］，這說明hPer3也可能通過類似機(jī)制作用于K562細(xì)胞，其表達(dá)缺失可能是慢粒表達(dá)的原因之一，但究竟hPer3的表達(dá)缺失是原發(fā)性還是繼發(fā)性引起的，值得進(jìn)一步研究。

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