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    心肌營(yíng)養(yǎng)素1誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為心肌樣細(xì)胞*

    2011-08-02 07:38:56彭朝權(quán)鄒麗媛
    中國(guó)病理生理雜志 2011年11期
    關(guān)鍵詞:空白對(duì)照心肌細(xì)胞分化

    彭朝權(quán), 高 雅, 項(xiàng) 鵬, 楊 珂, 鄒麗媛, 吳 曉

    (1中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院心內(nèi)科,廣東 廣州 510630;2中山大學(xué)干細(xì)胞與組織工程研究中心,廣東 廣州 510080)

    缺血性心臟病是全球高發(fā)的疾病之一,其本質(zhì)是心肌細(xì)胞的不可逆喪失。目前臨床積極進(jìn)行溶栓、介入等再灌注治療,但仍缺乏針對(duì)已經(jīng)梗死心肌細(xì)胞再生的根本性治療方法,梗死心肌形成無(wú)收縮功能的瘢痕組織,導(dǎo)致心功能改變,最終導(dǎo)致心衰。干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)與再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展為心肌細(xì)胞的再生帶來(lái)了新的希望,其中,成體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)易于獲取、擴(kuò)增,具有多分化潛能,且免疫源性較低[1],甚至具有免疫抑制作用[2],是心肌細(xì)胞再生有前途的種子細(xì)胞。近年來(lái),以5-氮雜胞苷(5-azacytidine,5-Aza)為先驅(qū)和代表,將MSCs誘導(dǎo)分化為有功能、乃至有電活動(dòng)的心肌細(xì)胞的研究始終在進(jìn)行[3]。新的誘導(dǎo)劑大致分為如下幾類:(1)細(xì)胞因子類,如血管內(nèi)皮生成因子,胰島素樣生長(zhǎng)因子,肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子,堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等;(2)炎癥因子類如白細(xì)胞介素-6,腎素、血管緊張素-Ⅰ、血管緊張素-Ⅱ等;(3)中醫(yī)藥類如黃芪甲甙、雙地龍、丹參酚酮、淫羊藿等。

    心肌營(yíng)養(yǎng)素1(cardiotrophin 1,CT-1)是白細(xì)胞介素-6細(xì)胞因子家族的一員,最早發(fā)現(xiàn)其促進(jìn)細(xì)胞肥大的作用,在先天性心臟病、心肌病、進(jìn)行性心力衰竭和心肌梗死等病理過程中均有過度表達(dá)。而CT-1誘導(dǎo)大鼠MSCs向心肌樣細(xì)胞分化的研究亦在進(jìn)行[4],其結(jié)果提示:CT-1可輔助5-Aza提高誘導(dǎo)率,但未能獨(dú)立將MSCs誘導(dǎo)為心肌細(xì)胞。因此,本研究將探討CT-1在MSCs誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞中的作用,明確其誘導(dǎo)功效。

    材料和方法

    1 材料

    1.1 動(dòng)物 小型豬1頭,6月齡,體重26 kg,雌性,南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證明編號(hào)No.0038589)。

    1.2 主要器材 超凈工作臺(tái),調(diào)溫低速離心機(jī)(Eppendorf),微型高速離心機(jī)(Eppendorf),Shel Lab 2323-2 CO2孵箱(Shel Lab),倒置顯微鏡(Olympus),電子天平,恒溫水浴箱(Shel Lab),純水儀,搖床,骨髓穿刺包等。

    1.3 主要試劑 CT-1(Invitrogen),5-Aza(Sigma),1073 g/L Ficoll人淋巴細(xì)胞分離液(Pharmacia),鼠抗豬α-actin單克隆抗體(Santa Cruz),羊抗豬心肌特異性肌鈣蛋白T(cardiac specific troponin T,cTnT)多克隆抗體(Abcam),TRITC標(biāo)記的羊抗小鼠 IgG(Protein Tech Group),Hoechst染色液,DMEM-F12培養(yǎng)基,胎牛血清,胰蛋白酶,肝素鈉注射液,Triton X-100,速眠新及4%多聚甲醛等。

    2 方法

    2.1 原代骨髓MSCs的分離、培養(yǎng)及擴(kuò)增 全麻后,穿刺小型豬髂后上棘多點(diǎn)吸取約40-50 mL骨髓液(等量 PBS稀釋,肝素抗凝);加入 Ficoll液,2000 r/min離心20 min;吸取白膜層,加入等量PBS,1100 r/min離心4 min;去上清,加入用含 10%FBS的L-DMEM培養(yǎng)基重懸,按(2-3)×105/cm2的濃度接種于6孔板,置37℃、5%CO2、飽和濕度的孵箱培養(yǎng)。細(xì)胞80% -90%融合時(shí),0.25%的胰蛋白酶消化,按1∶2比例傳代擴(kuò)增至第4-6代,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MSCs,消化離心,按1×107/L接種于24孔板,37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)。加入DMSO 250 μL,振蕩10 min。

    2.2 MSCs分化能力的鑒定

    ①成骨誘導(dǎo) 將細(xì)胞按2×104/cm2密度接種于6孔板,生長(zhǎng)至80%時(shí),加成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo),約12 d可見細(xì)胞聚集為鈣化結(jié)節(jié),逐漸增多增大,21 d后鈣化結(jié)節(jié)行茜素紅染色。

    ②成脂誘導(dǎo) 將細(xì)胞按2×104/cm2密度接種于6孔板,生長(zhǎng)至80%時(shí),加成脂誘導(dǎo)液A誘導(dǎo),3 d后換液并再予成脂B液誘導(dǎo),如此循環(huán)約至14 d行油紅O染色。

    2.3 多組誘導(dǎo)分化 將MSCs均勻接種于12孔板,每張板上分為4組,每組共3孔,組內(nèi)處理方法相同,A:空白對(duì)照組(無(wú)血清培養(yǎng)基);B:5-Aza組(含10 μmol/L 5-Aza的無(wú)血清培養(yǎng)基);C:CT-1組(含0.1 μg/L CT-1的無(wú)血清培養(yǎng)基);D:合用組(10 μmol/L 5 -Aza+0.1 μg/L CT -1 的無(wú)血清培養(yǎng)基)。當(dāng)細(xì)胞增殖至每孔面積的80%時(shí),加入上述濃度誘導(dǎo)液作用24 h,用原10%胎牛血清培養(yǎng)基的L-DMEM換液,于 37℃、5%CO2的孵育箱中培養(yǎng),不加任何干擾因素,隔3 d換液,觀察細(xì)胞形態(tài)。免疫熒光檢測(cè)以及計(jì)算細(xì)胞熒光陽(yáng)性率:取誘導(dǎo)后28 d的細(xì)胞行α-actin和cTnT免疫熒光染色,并計(jì)數(shù)誘導(dǎo)后28 d各組細(xì)胞的陽(yáng)性染色率。(1)0.01 mol/L PBS洗滌;(2)4%多聚甲醛固定,0.01 mol/L PBS洗滌;(3)0.2%Triton X-100穿透半小時(shí),0.01 mol/L PBS洗滌;(4)滴加10%正常山羊血清封閉細(xì)胞;(5)棄血清后分別加入Ⅰ抗α-actin,cTnT(0.01 mol/L PBS 1∶200稀釋),陰性對(duì)照組用0.01 mol/L PBS替代;(6)濕盒中保存,4℃過夜;(7)予0.01 mol/L PBS洗滌;(8)在避光條件下加入TRITC結(jié)合1 h,予0.01 mol/L PBS洗滌;(9)Hoechst染色法染細(xì)胞核10 min,予0.01 mol/L PBS洗滌;(10)熒光顯微鏡下觀察,分別觀測(cè)藍(lán)色、紅色熒光。計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)的細(xì)胞數(shù)(N)和紅色熒光陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(Ni);計(jì)算MSCs分化為心肌樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率(Ni/N×100%)。

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。

    結(jié) 果

    1 西藏小型豬MSCs的培養(yǎng)情況

    接種到6孔板的原代細(xì)胞,被大量紅細(xì)胞覆蓋,24 h后首次換液,隱約可見孔底少量貼壁細(xì)胞,1周可見多個(gè)長(zhǎng)梭形細(xì)胞集落,見圖1A,核圓居中,含1-3個(gè)核仁。約12 d首次按2×104/cm2密度傳代,細(xì)胞貼壁后形態(tài)如前,約9-12 d密集生長(zhǎng)至80%-90%,見圖1B,傳代繼續(xù)培養(yǎng)。

    Figure 1.Morphology of the MSCs under an inverted microscope(×100).A:6 d after inoculation,spindle-shaped cells were observed;B:12 d after inoculation,MSCs reached 80% -90%.圖1 相差顯微鏡下MSCs形態(tài)學(xué)觀察

    取第4代細(xì)胞行成骨誘導(dǎo),約12 d可見細(xì)胞聚集為鈣化結(jié)節(jié),逐漸增多增大,21 d后鈣化結(jié)節(jié)茜素紅染色陽(yáng)性,見圖2A。進(jìn)行成脂誘導(dǎo),7 d后,細(xì)胞已由長(zhǎng)梭形變?yōu)槎嘟切?,?xì)胞體積逐漸增大,胞質(zhì)內(nèi)有圓球形半透明脂滴形成,部分細(xì)胞胞核擠向一側(cè),第14 d行油紅O染色,胞核周圍紅染,見圖2B。

    Figure 2.Osteogenic and adipogenic differentiation.A:alizarin red staining for osteogenesis on day 21,showing orange-red calcium nodules(×200);B:oil red O staining for adipogenesis on day 14(×400).These results indicate that MSCs are multipotent.圖2 MSCs成骨成脂分化結(jié)果

    2 MSCs向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化

    誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后第14 d起,可見除空白對(duì)照組外,各組均有部分細(xì)胞形態(tài)變寬,體積逐漸增大,約21 d起,可見細(xì)胞生長(zhǎng)減慢,細(xì)胞回縮變短,細(xì)胞聚集生長(zhǎng)趨勢(shì),細(xì)胞排列具有明顯的方向性,具有短棒狀結(jié)構(gòu)及位于中心的細(xì)胞核,核/漿比例明顯降低,見圖3。培養(yǎng)至28 d,上述傾向仍明顯,但各組均有部分細(xì)胞形態(tài)漸趨扁平,胞核扁圓,出現(xiàn)空泡,并有少量細(xì)胞失去規(guī)則形態(tài),核仁消失,細(xì)胞死亡。

    Figure 3.Morphology of MSCs 28 d after induction with 5-Aza(×100).圖3 5-Aza誘導(dǎo)后28 d光鏡下觀察

    3 細(xì)胞免疫熒光結(jié)果

    按每組1個(gè)孔選3個(gè)400倍視野計(jì)數(shù)3次,取Hoechst法藍(lán)染的細(xì)胞核數(shù)為MSCs細(xì)胞總數(shù),取明亮以及可見紅色熒光的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞。在熒光顯微鏡下,分別觀察各組藍(lán)色、紅色熒光的表達(dá),并合成于同一幅圖片中,記錄其紅色熒光表達(dá)率。免疫熒光染色結(jié)果顯示,陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組可見極少量紅色熒光光點(diǎn),略呈圓形,形狀較正常MSCs小,有些周圍未見顯示藍(lán)色熒光的細(xì)胞核,提示可能為雜質(zhì)所導(dǎo)致的假陽(yáng)性,見圖4A、E。CT-1組、5-Aza組和合用組均可見部分細(xì)胞顯示紅色熒光,與顯示藍(lán)色熒光的細(xì)胞核重合。其中,合用組紅色熒光細(xì)胞數(shù)最多,見圖4B、C、D、F、G、H。其中 CT -1 組具有較典型的紅色熒光細(xì)胞的表達(dá)。

    Figure 4.Immunofluorescence staining results in each group(×100).A:Hoechst nuclear dye in control group;B:Hoechst nuclear dye in CT-1 group;C:Hoechst nuclear dye in 5-Aza group;D:Hoechst nuclear dye in CT-1 and 5-Aza group;E:red fluorescence in control group;F:red fluorescence in CT-1 group;G:red fluorescence in 5-Aza group;H:Red fluorescence in CT-1 and 5-Aza group.圖4 各組細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果

    4 各組分化為心肌細(xì)胞陽(yáng)性率比較

    由圖5可見,合用組的誘導(dǎo)分化心肌樣細(xì)胞αactin陽(yáng)性率為29.90% ±4.76%,明顯大于5-Aza組(17.73% ±2.35%,P<0.01)、CT-1組(6.63%±0.55%,P<0.01)和空白對(duì)照組(1.62% ±0.09%,P<0.01);5-Aza組明顯大于CT-1組(P<0.01)和空白對(duì)照組(P<0.01);CT-1組明顯大于空白對(duì)照組(P<0.05)。

    cTnT紅色熒光染色結(jié)果顯示,合用組的誘導(dǎo)分化心肌樣細(xì)胞cTnT陽(yáng)性率為36.50% ±4.09%,明顯大于5-Aza組(14.37% ±1.65%,P<0.01)、CT-1組(7.50% ±0.61%,P<0.01)和空白對(duì)照組(1.12% ±0.23%,P<0.01);5-Aza組明顯大于CT-1組(P<0.01)和空白對(duì)照組(P<0.01);CT-1組明顯大于空白對(duì)照組(P<0.01)。

    討 論

    Figure 5.The percentage of positive expression of α - actin and cTnT in each group..n=3.**P<0.01 vs contnol;##P<0.01 vs CT-1 or 5-Aaz group.圖5 各組誘導(dǎo)分化細(xì)胞α-actin和cTnT陽(yáng)性表達(dá)率

    干細(xì)胞和前體細(xì)胞再生潛能的發(fā)現(xiàn)為從根本上治療心肌梗死和預(yù)防心梗后心衰提供了可能性,因此心肌細(xì)胞再生的實(shí)驗(yàn)研究與臨床探索均在蓬勃開展[5]。MSCs易于獲取、分離、擴(kuò)增,以及弱的免疫抗原性,尤其是易于外源基因的導(dǎo)入[6],且可保持其未分化特性,為作為基因載體治療遺傳缺陷性疾病奠定了基礎(chǔ)。要提高M(jìn)SCs的療效,經(jīng)基因修飾過度表達(dá)血管生成因子[7]、生長(zhǎng)因子或干細(xì)胞歸巢因子等細(xì)胞因子作為旁分泌因子均為目前的研究熱點(diǎn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)過修飾的MSCs治療急性心肌梗死,比單純的細(xì)胞治療組和基因治療組能更好地改善心肌灌注、修復(fù)心臟功能[8]。另外,由于豬的心臟功能與結(jié)構(gòu)均與人類相似度最高,是最常用的大型動(dòng)物。因此,本課題選擇西藏小型豬MSCs為研究對(duì)象,為進(jìn)一步的在體實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。此外,本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)細(xì)胞貼壁率及細(xì)胞活力觀察,表明我們分離到的西藏小型豬MSCs的存活能力很強(qiáng),細(xì)胞穩(wěn)定,存活率高,細(xì)胞生長(zhǎng)狀況好。而對(duì)其分化潛能的測(cè)定方面,成骨與成脂均獲得較好的誘導(dǎo)效果,提示其具有良好的分化潛能。

    CT-1是IL-6細(xì)胞因子家族的一員,能促使體外心肌細(xì)胞肥大,遂命名為心肌營(yíng)養(yǎng)素 1[9]。在1995年研究高血壓心肌細(xì)胞肥大時(shí)被首次發(fā)現(xiàn)[10],后來(lái)CT-1又被發(fā)現(xiàn)在多種心臟病理過程中,均有過度表達(dá),乃至于一段時(shí)間內(nèi)被作為心血管疾病生物標(biāo)記物被研究,進(jìn)一步研究提示其水平的升高或許是機(jī)體的一種保護(hù)性反應(yīng),在對(duì)保持心臟正常功能及心臟疾病的發(fā)生、發(fā)展方面有重要意義[11]。gp130是IL-6細(xì)胞因子家族共有的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,為I型膜蛋白分子,由3部分組成:與配體結(jié)合的胞外區(qū)、有激酶活性的胞內(nèi)區(qū)和跨膜區(qū)。gp130蛋白含918個(gè)氨基酸,其中信號(hào)肽和跨膜區(qū)各22個(gè)殘基,胞外區(qū)和胞漿區(qū)分別含597和277個(gè)殘基[12]。在心肌細(xì)胞,CT-1通過2條途徑起作用:一條是通過激活蛋白激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(JAK/STAT3)途徑引起心肌肥大和保護(hù)心?。?,12]。CT-1先與心肌細(xì)胞上的跨膜受體gp130/LIFR結(jié)合,gp130和白血病抑制因子受體β亞基酪氨酸磷酸化,促進(jìn)二聚體,并與其特異性α受體結(jié)合,從而激活與受體相連的JAK1、JAK2和Tyk2等,并使信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活物3(STAT3)酪氨酸磷酸化形成二聚體,再轉(zhuǎn)位至核內(nèi)與靶基因增強(qiáng)子元件結(jié)合激活轉(zhuǎn)錄,產(chǎn)生一系列與心肌肥厚有關(guān)的效應(yīng)。Liao等[13]的研究亦表明,在心肌缺血-再灌注后注射CT-1能明顯對(duì)抗心肌缺血引起的損傷,這種保護(hù)作用通過蘇氨酸磷酸化激活蛋白激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(MAPK通路)的抑制而被拮抗,應(yīng)用的MAPK特異性抑制劑PD98059能夠阻止MAPK的激活,阻斷CT-1促進(jìn)心肌細(xì)胞生存的作用,導(dǎo)致細(xì)胞活力喪失。而有研究認(rèn)為,MAPK途徑與分化終末的細(xì)胞存活有關(guān)[14]。亦有研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)MAPK通路受抑制的同時(shí),STAT3過度表達(dá)所誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大、部分mRNA的表達(dá)以及蛋白的合成也被抑制,說(shuō)明這2條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在心肌細(xì)胞肥大中發(fā)生了“交叉對(duì)話”,互相影響,互相聯(lián)系,形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng),進(jìn)而表現(xiàn)為CT-1的多種生物學(xué)功能[15]。

    Makino等[3]將從小鼠骨髓中分離出的MSCs連續(xù)傳代,得到永生型細(xì)胞,在5-Aza的作用下誘導(dǎo)分化,1周后觀察到約30%MSCs細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,細(xì)胞體積變大,向同一方向延展成棒狀,2周后與周圍細(xì)胞相連。3周后通過閏盤與相鄰細(xì)胞連接,形成微管樣結(jié)構(gòu)。此后國(guó)內(nèi)外多次報(bào)道并證實(shí)相關(guān)結(jié)論。從而為MSCs誘導(dǎo)分化成為心肌細(xì)胞用于細(xì)胞移植與基因治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但上述相關(guān)報(bào)道的動(dòng)物模型多為以嚙齒類動(dòng)物如大鼠、小鼠。

    關(guān)于大型動(dòng)物模型西藏小型豬MSCs經(jīng)5-Aza誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞的報(bào)道尚不多見。因此本課題選擇5-Aza作為陽(yáng)性對(duì)照的誘導(dǎo)劑,并在預(yù)實(shí)驗(yàn)中嘗試了從2.5 μmol/L到20 μmol/L等多種濃度,驗(yàn)證10 μmol/L的誘導(dǎo)濃度下,細(xì)胞的形態(tài)變化較明顯,且細(xì)胞毒性較小;而當(dāng)濃度為15 μmol/L及以上時(shí),加入誘導(dǎo)劑24 h內(nèi),部分細(xì)胞即出現(xiàn)皺縮,喪失貼壁狀態(tài),聚集成團(tuán)脫落。因此實(shí)驗(yàn)組均選擇10 μmol/L的誘導(dǎo)濃度。本課題的結(jié)果證實(shí)了5-Aza對(duì)于西藏小型豬MSCs的誘導(dǎo)分化能力。另外,亦有研究表明:部分未經(jīng)化學(xué)誘導(dǎo)的MSCs經(jīng)長(zhǎng)期傳代后,持續(xù)培養(yǎng),生長(zhǎng)至融合時(shí)亦可出現(xiàn)肌管樣結(jié)構(gòu),因而認(rèn)為MSCs具有長(zhǎng)期傳代增殖后,可自發(fā)出現(xiàn)肌源性轉(zhuǎn)化的生物學(xué)生長(zhǎng)特性,而非必然是誘導(dǎo)的結(jié)果[16]。因此本課題在設(shè)置空白對(duì)照組的同時(shí),亦設(shè)置了相應(yīng)的陰性對(duì)照組,并選擇了第6代細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,空白對(duì)照組的誘導(dǎo)陽(yáng)性率與陰性對(duì)照組的誘導(dǎo)陽(yáng)性率相比較,其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明第6代MSCs持續(xù)培養(yǎng)28 d時(shí),未出現(xiàn)明顯的自發(fā)性肌源性轉(zhuǎn)化。而5-Aza組的MSCs出現(xiàn)了部分細(xì)胞表達(dá)心肌細(xì)胞特異性抗原,說(shuō)明5-Aza能夠?qū)⑿⌒拓iMSCs誘導(dǎo)成為心肌樣細(xì)胞。但是,對(duì)于所謂“心肌樣細(xì)胞”的認(rèn)定,如有條件,可行電鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu),并進(jìn)一步從分子生物學(xué)水平研究細(xì)胞表達(dá)的情況,并研究細(xì)胞的電生理活動(dòng)情況及細(xì)胞之間的聯(lián)系。

    本課題選擇CT-1作為一種有前途的誘導(dǎo)劑進(jìn)行研究,并以5-Aza作為陽(yáng)性對(duì)照,研究CT-1誘導(dǎo)西藏小型豬MSCs分化為心肌樣細(xì)胞中的作用。CT-1說(shuō)明書中以0.1 μg/L作為其毒性作用濃度的上限,因此在預(yù)實(shí)驗(yàn)中,我們?cè)O(shè)置了0.1 μg/L、0.05 μg/L、0.025 μg/L濃度組。在誘導(dǎo)作用1 d后,各組均未出現(xiàn)明顯的細(xì)胞中毒及死亡情況。在連續(xù)培養(yǎng)28 d后,各組死亡及狀態(tài)差的比例未觀察到明顯的差異。因此,在正式實(shí)驗(yàn)中,確定0.1 μg/L作為誘導(dǎo)濃度。在最終的誘導(dǎo)結(jié)果中,CT-1組的誘導(dǎo)率與空白對(duì)照組有顯著差異,證實(shí)了0.1 μg/L的CT-1能夠單獨(dú)在體外誘導(dǎo)西藏小型豬MSCs轉(zhuǎn)化為心肌樣細(xì)胞,誘導(dǎo)后的細(xì)胞獲得部分心肌細(xì)胞特異性蛋白(α-actin、cTnT)的表達(dá)。而在合用組中,CT-1(0.1 μg/L)與 5 - Aza(10 μmol/L)合用能夠顯著提高西藏小型豬MSCs轉(zhuǎn)化為心肌樣細(xì)胞的誘導(dǎo)率。CT-1能夠?qū)⑽鞑匦⌒拓iMSCs誘導(dǎo)分化為心肌樣細(xì)胞,其誘導(dǎo)率高于空白對(duì)照組(P<0.05),但低于5-Aza組(P<0.01);而CT-1與5-Aza的合用誘導(dǎo)液誘導(dǎo)分化的效率與單獨(dú)的5-Aza組比較,效率顯著提高,其差異顯著(P<0.01)。因此我們認(rèn)為CT-1和5-Aza均可以誘導(dǎo)MSCs向心肌樣細(xì)胞分化,這為下一步用CT-1修飾MSCs移植治療急性心肌梗死提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    [1]Ozawa K,Sato K,Oh I,et al.Cell and gene therapy using mesenchymal stem cells[J].J Autoimmun,2008,30(3):121-127.

    [2]Laflamme MA,Chen KY,Naumova AV.Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts[J].Nat Biotechnol,2007,25(9):1015 -1024.

    [3]Makino S,F(xiàn)ukuda K,Miyoshi S,et al.Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro[J].Clin Invest,1999,103(5):697 -705.

    [4]陳新云,曾 智,饒 莉,等.心臟營(yíng)養(yǎng)素-1對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為心肌樣細(xì)胞的作用[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2009,40(1):85-89.

    [5]Segers VF,Lee RT.Stem -cell therapy for cardiac disease[J].Nature,2008,451(7181):937 -942.

    [6]Caplan A.Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus regenerative medicine[J].J Cell Physiol,2007,213(2):341–347.

    [7]陳柏齡,陳東平,張志堅(jiān),等.Ang-1基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療腦梗死的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)病理生理雜志,2009,25(2):241-247.

    [8]Breitbach M,Bostani T,Roell W,et al.Potential risks of bone marrow cell transplantation into infarcted hearts[J].Blood,2007,110(4):1362-1369.

    [9]Heinrich PC,Behrmann I,Muller-Newen G,et al.Interleukin-6 type cytokine signalling through the gp130/Jak/STAT pathway[J].Biochem J,1998,334(Pt 2):297–314.

    [10]Pennica D,King KL,Shaw KJ,et al.Expression cloning of cardiotrophin 1,a cytokine that induces cardiac myocyte hypertrophy[J].Proc Natl Acad Sci USA,1995,92(4):1142-1146.

    [11]Clerico A.The increasing impact of laboratory medicine on clinical cardiology[J].Clin Chem Lab Med,2003,41(7):871-883.

    [12]Wollert KC,Taga T,Saito M,et al.Cardiotrophin-1 activates a distinct form of cardiac muscle cell hypertrophy.Assembly of sarcomeric units in series via gp130/leukemia inhibitory factor receptor 2 dependent pathways[J].J Biol Chem,1996,271(16):9535-9545.

    [13]Liao R,Pfister O,Jain M,et al.The bone marrow–cardiac axis of myocardial regeneration[J].Prog Cardiovasc Dis,2007,50(1):18 -30.

    [14]Sheng Z,Knowlton K,Chen J,et al.Cardiotrophin -1(CT-1)inhibition of cardiac myocyte apoptosis via a mitogen-activated protein kinase-dependent pathway.Divergence from downstream CT-1 signals for myocardial cell hypertrophy[J].J Biol Chem,1997,272(9):5783–5791.

    [15]Calabrò P,Limongelli G,Riegler L,et al.Novel insights into the role of cardiotrophin-1 in cardiovascular diseases[J].J Mol Cell Cardiol,2009,46(2):142 -148.

    [16]Liu Y,Song J,Liu WX,et al.Growth and differentiation of rat bone marrow stromal cells:does 5-azacytidine trigger their cardiomyogenic differentiation?[J].Cardiovas Res,2003,58(2):460 -468.

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