大鼠組織工程人工骨的體外動(dòng)態(tài)灌注培養(yǎng)構(gòu)建

張 波 權(quán) 毅 謝慶云 潘顯明 伍紅樺 趙凱敏 屈 波 廖冬發(fā) 鄧 斌

(解放軍成都軍區(qū)總醫(yī)院骨科，四川 成都 610083)

創(chuàng)傷及多種原因造成的骨缺損病變?nèi)找嬖龆?，影響患者活?dòng)和勞動(dòng)能力。隨著近年構(gòu)建工程化組織研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)牧W(xué)刺激因素可以克服傳統(tǒng)骨細(xì)胞培養(yǎng)條件的不足，滿足細(xì)胞在可吸收細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中營(yíng)養(yǎng)的需要，減少處于中心部位的細(xì)胞由于營(yíng)養(yǎng)不良或代謝不暢而導(dǎo)致的生長(zhǎng)遲滯甚至死亡〔1，2〕。因此，研究力學(xué)刺激對(duì)體外三維立體培養(yǎng)細(xì)胞的作用有重要意義。本文探討采用動(dòng)態(tài)灌注培養(yǎng)方法應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)在納米復(fù)合羥基磷灰石接枝聚乳酸(HA/PLA)材料構(gòu)建SD大鼠骨組織的效果與應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 支架材料 生物活性可降解HA/PLA納米復(fù)合多孔材料由四川大學(xué)提供，該復(fù)合材料在PLA上接枝HA和具有促進(jìn)細(xì)胞黏附的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列，其孔隙率為93% ～95%，孔徑為400～650 μm，壓縮強(qiáng)度為120 mPa，壓縮模量0.8 Gpa。制成直徑為20 mm，厚度5 mm圓片，環(huán)氧乙烷熏蒸消毒后備用。

1.2 原代培養(yǎng) 取10月齡SD大鼠(由四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)適應(yīng)性飼養(yǎng)2 w，參照文獻(xiàn)方法取股骨骨髓〔3，4〕，用低糖DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)原代分離培養(yǎng)MSC，傳至第3代，分別按照2×104和2×105ml－1密度接種于多孔支架上。

1.3 灌注實(shí)驗(yàn) 灌流培養(yǎng)系統(tǒng)由樣品池、蠕動(dòng)泵、硅膠管道以及培養(yǎng)液瓶組成。分別在0.3，0.6和0.9 ml/min灌注速度實(shí)驗(yàn)。并于灌流培養(yǎng)7 d取出細(xì)胞/支架復(fù)合物，通過MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖情況。

1.4 堿性磷酸酶(ALP)活性檢測(cè) 培養(yǎng)15 d后取細(xì)胞支架復(fù)合物，切碎，反復(fù)凍融法裂解細(xì)胞，取裂解液30 μl與0.5 ml緩沖液及0.5 ml基質(zhì)液充分混勻，37℃水浴15 min，按照試劑盒說明書加入1.5 ml顯色劑，混勻，在520 nm處測(cè)各管吸光度。1.5 形態(tài)學(xué)觀察 于灌注培養(yǎng)第15天取出細(xì)胞支架復(fù)合物，PBS清洗，從中間切開，加熒光素二乙醋，37℃孵育5 min后，PBS洗滌，顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。另一部分細(xì)胞/支架復(fù)合物，經(jīng)固定、梯度脫水、石蠟包埋后，切片(厚度6 μm)，行HE染色，顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 灌注培養(yǎng)對(duì)細(xì)胞增殖的影響 MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，與靜止培養(yǎng)相比較，灌注培養(yǎng)7 d細(xì)胞在支架中的活力顯著增加，且細(xì)胞活力隨著接種細(xì)胞密度的增大而增加，表明灌注培養(yǎng)可以促進(jìn)細(xì)胞增殖。在相同細(xì)胞密度條件下，中速(0.6 ml/min)與快速灌注(0.9 ml/min)較慢速(0.3 ml/min)顯著促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng);中速與快速灌注對(duì)細(xì)胞增殖影響差別不顯著。通過正交法表明最佳培養(yǎng)條件為:細(xì)胞密度2×105ml-1，灌注流速為0.6或0.9 ml/min。

表1 MTT法測(cè)定不同接種密度MSC在不同灌注速度增殖情況(，n=3)

表1 MTT法測(cè)定不同接種密度MSC在不同灌注速度增殖情況(，n=3)

與0.3 ml/min比較:1)P＜0.05;與對(duì)照組比較:2)P＜0.05

組別 2×104ml－1 0 0.3 ml/min 0.6 ml/min 0.9 ml/min 2×105ml-1 0 0.3 ml/min 0.6 ml/min 0.9 ml/min實(shí)驗(yàn)組 － 0.47±0.052) 0.57±0.041)2) 0.59±0.051)2) － 0.83±0.05 0.95±0.061)2) 0.98±0.051)2)對(duì)照－組0.39±0.04 － － － 0.71±0.06 － －

2.2 ALP活性檢測(cè) 分別于體外培養(yǎng)15 d取樣，切碎，經(jīng)組織勻漿，使用ALP測(cè)定試劑盒進(jìn)行ALP活性檢測(cè)。在接種細(xì)胞密度為2×105ml-1時(shí)，與靜止培養(yǎng)(0.007±0.001)比較，灌注培養(yǎng)(灌注速度為0.6 ml/min)骨組織ALP活性(0.063±0.001)明顯增高，證明實(shí)驗(yàn)組更能促進(jìn)MSC向成骨細(xì)胞分化。

2.3 灌注培養(yǎng)對(duì)骨組織形態(tài)的作用 熒光和HE染色可見成骨細(xì)胞在支架中均勻分布，證明通過MSC誘導(dǎo)分化成骨細(xì)胞能夠在HA/PLA三維多孔支架上生長(zhǎng)。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)量和密度更大，因而可以推斷出灌流培養(yǎng)產(chǎn)生的剪切力更適合人工骨組織構(gòu)建，用灌注生物反應(yīng)器系統(tǒng)來進(jìn)行MSC的三維立體擴(kuò)增和分化是可行的，可以用于骨組織工程研究。

3 討論

組織工程為修復(fù)骨缺損提供了一個(gè)新的思路和方法。種子細(xì)胞在復(fù)合支架材料上通過體外擴(kuò)增、共培養(yǎng)，形成與骨組織結(jié)構(gòu)與功能相似的新生組織來修復(fù)骨缺損。MSC是一種理想的組織工程種子細(xì)胞。體外培養(yǎng)的MSC具有強(qiáng)大的增殖能力，而且具有多向分化潛能。支架中生長(zhǎng)的細(xì)胞首先要能夠分布均勻，以獲得均勻的新生組織。多孔支架應(yīng)具有促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖和分化的功能，以提高新生組織的生成速度。PLA及其共聚物具有良好的生物降解性和組織相容性，在軟骨和骨組織工程應(yīng)用中顯示出較好的性能而被廣泛應(yīng)用。本文采用的生物活性多孔 HA/PLA，在合成高分子 PLA上接枝 HA和RGD，既有骨修復(fù)成分HA，又有增強(qiáng)細(xì)胞黏附的短肽序列。結(jié)果顯示，生物活性HA/PLA支架能夠促進(jìn)MSC黏附和遷移。將MSC以一定的密度接種到HA/PLA支架中后進(jìn)行灌流培養(yǎng)，細(xì)胞保持了較高的活力和增殖活性，基質(zhì)分泌旺盛。由此證明，對(duì)于MSC的三維立體培養(yǎng)和擴(kuò)增是高效、可行的。

灌注式培養(yǎng)利用細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液流經(jīng)支架材料的孔隙給細(xì)胞提供足夠的物質(zhì)輸送，同時(shí)提供一定的機(jī)械剪應(yīng)力刺激作用，適合大塊組織的體外構(gòu)建。對(duì)比于靜態(tài)培養(yǎng)，灌注反應(yīng)體系可促進(jìn)細(xì)胞的活力和功能，增強(qiáng)成骨分化而且使細(xì)胞在支架內(nèi)的分布更均勻。

1 宋 飛，梅冠宇，宋克東，等.成骨細(xì)胞不同體外培養(yǎng)方式的耗氧速率檢測(cè)〔J〕.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2008;12(24):4606-9.

2 閆香珍，楊丕山.骨組織工程技術(shù)瓶頸及其原因分析〔J〕.國(guó)際口腔醫(yī)學(xué)雜志2009;36(1):117-9.

3 田 甜，章慶國(guó).力學(xué)刺激促進(jìn)軟骨細(xì)胞與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)體外軟骨分化〔J〕.中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2009;18(5):658-62.

4 陳 鵬，劉 冰，毛天球.納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸材料復(fù)合自體骨髓基質(zhì)細(xì)胞修復(fù)犬下頜骨節(jié)段性缺損的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.北京口腔醫(yī)學(xué)，2009;17(4):195-8.