塞來昔布抑制宮頸癌細(xì)胞株Hela體外遷移效應(yīng)的研究

劉利波,程 青,唐忠志,陳書琴

(廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院急診科,湖北武漢,430070)

宮頸癌[1]是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一,嚴(yán)重威脅婦女的健康和生命。放射治療作為其綜合治療的重要手段之一,療效受到關(guān)注。腫瘤對(duì)放射線抗拒,正常組織限制放療劑量的增加以及腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)程轉(zhuǎn)移成為放療失敗的主要原因。大量研究表明,環(huán)氧化酶-2(COX-2)與腫瘤有高度相關(guān)性。在多種惡性腫瘤組織中有COX-2的高表達(dá),它參與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、生長(zhǎng)、凋亡過程,同時(shí)也參與腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、遷移、腫瘤新生血管的形成[2-3]。本實(shí)驗(yàn)以人宮頸癌細(xì)胞株Hela為靶細(xì)胞,觀察選擇性COX-2抑制劑塞來昔布(Celecoxib)對(duì)其體外遷移力及分泌MMP-2的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

塞來昔布(Celecoxib,商品名:西樂葆,美國(guó)輝瑞公司),人宮頸癌細(xì)胞株Hela(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所),RPMI-1640培養(yǎng)基(GIBCO公司),小牛血清(杭州四季清公司),二甲基亞砜(DMSO,GIBCO公司),MMP-2 human ELISA KIT96T試劑盒(武漢博士德生物),CO2培養(yǎng)箱(上海HERAEUS BB5060型),醫(yī)用電子直線加速器(SIMENS P-M 型),倒置顯微鏡(日本OLYMPUS CK-40型),酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(BIORED公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

細(xì)胞培養(yǎng):人宮頸癌細(xì)胞株Hela用25CM2培養(yǎng)瓶貼壁培養(yǎng)于 RPMI-1640培養(yǎng)基中(含10%小牛血清、100 μ/mL 青鏈霉素),在 37 ℃含5%CO2濃度、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)連續(xù)培養(yǎng),2～3 d換液1次,0.25%胰蛋白酶常規(guī)消化傳代,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)。

照射方法:SIMENS P-M型直線加速器6MV-X線垂直照射,劑量率為2 Gy/min,照射時(shí)機(jī)架旋轉(zhuǎn)180°,貼壁細(xì)胞表面加1.5 cm組織等效填充物,源皮距(SSD)為100 cm,射野10 cm×10 cm。

細(xì)胞劃痕試驗(yàn):藥物塞來昔布(Celecoxib)用二甲基亞砜(DMSO)溶解,加入不含小牛血清的RPMI-1640配制成濃度為10 mmol/L的母液,置于4℃冰箱保存,臨用時(shí)用培養(yǎng)液稀釋到所需濃度,DMSO終濃度<0.2%。

四氮唑鹽(MTT)比色預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示,30 μ mol/L、50 μ mol/L Celecoxib 作用 Hela 細(xì)胞 48 h 后增殖抑制率不超過 30%。故選取 30 μ mol/L、50 μ mol/L藥物濃度作為實(shí)驗(yàn)研究。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Hela細(xì)胞,接種于六孔板中,分對(duì)照組(C)、藥物組(D)、照射組(R)和藥物+照射組(R+D),設(shè)0、6 Gy 2個(gè)劑量點(diǎn),置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞覆蓋孔底80%以上時(shí),在單層細(xì)胞表面用200 μ L槍頭在孔中劃1條直線,無菌PBS漂洗2次去除劃下的懸浮細(xì)胞,D組及R+D組每孔加入Celecoxib,使其終濃度分別為30 μ mol/L、50 μ mol/L,C 組及 R 組加入等量的DMSO,R組及R+D組置于加速器下照射。而后置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h,倒置顯微鏡＊100觀察細(xì)胞遷移情況。

酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)MMP-2:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Hela細(xì)胞,以密度為1.0×106/孔接種于六孔板中,細(xì)胞分組同前,設(shè)0、6 Gy兩個(gè)劑量點(diǎn)。接種6～8 h后,鏡下觀察細(xì)胞已貼壁,D組及R+D組每孔加入Celecoxib,使其終濃度分別為 30 μ mol/L、50 μ mol/L,C 組及 R 組加入等量DMSO,R組及 R+D組置于加速器下照射。各組細(xì)胞處理后置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后,收集各孔細(xì)胞的培養(yǎng)上清液,離心去除細(xì)胞碎片,按照ELISA試劑盒的操作說明對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行檢測(cè),在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)是492 nm波長(zhǎng)的吸光度值(OD值)。通過標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及OD值繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)樣品的OD值在該曲線上查出相應(yīng)的MMP-2含量。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 Celecoxib聯(lián)合放射后對(duì)Hela細(xì)胞遷移力的影響

各組細(xì)胞劃線后在鏡下視野中均可見1條細(xì)長(zhǎng)等寬的無細(xì)胞劃痕區(qū)。48 h后C組細(xì)胞運(yùn)動(dòng)遷移基本上覆蓋了大部分劃痕區(qū);D組隨著Celecoxib濃度增加,無細(xì)胞劃痕區(qū)逐漸增寬;R組較C組無細(xì)胞劃痕區(qū)無明顯改變;R+D組較R組、D組無細(xì)胞劃痕區(qū)均增寬,且隨著藥物濃度增加而增寬。

2.2 Celecoxib聯(lián)合放射后對(duì)Hela細(xì)胞分泌MMP-2的影響(表1)

Celecoxib聯(lián)合放射后對(duì)Hela細(xì)胞分泌MMP-2的影響見表1。

表1 Celecoxib聯(lián)合放射后對(duì)Hela細(xì)胞分泌MMP-2的影響

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn),D組較C組,R+D組較R組、R+D(50 μ mol/L)組較 R+D(30 μ mol/L)組細(xì)胞上清液MMP-2的分泌量均明顯下降(P<0.05),但R組與C 組、D 組(50 μ mol/L)與D 組(30 μ mol/L)對(duì)細(xì)胞分泌MMP-2的抑制效應(yīng)并無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 討 論

宮頸癌[1]的發(fā)病率及死亡率逐年增加,放射治療在其綜合治療中占十分重要的地位。如何提高放射治療療效、避免或減少腫瘤遠(yuǎn)地轉(zhuǎn)移已成為腫瘤放射治療學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)[4-5]。

研究表明,環(huán)氧合酶(COX)的誘生性同工酶COX-2存在于多種惡性腫瘤及癌前病變,COX-2抑制劑作為抗腫瘤藥物或放射增敏藥也已成為目前的研究熱點(diǎn)之一。Celecoxib(商品名西樂葆)由美國(guó)輝瑞制藥公司生產(chǎn),1999年經(jīng)FDA批準(zhǔn)在美國(guó)上市,對(duì)COX-2具有高度選擇性,是第一個(gè)用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的COX-2選擇性抑制劑,并于2000年通過美國(guó)FDA用于家族性結(jié)腸息肉病(FAP)的治療[6],對(duì)其它腫瘤預(yù)防和治療作用的研究也在進(jìn)行中。

腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致放射治療失敗的主要原因之一。腫瘤細(xì)胞從原位增殖到發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的演進(jìn)過程是一個(gè)多階段的復(fù)雜過程,必須具備降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的能力。分泌型 MMP-2是MMPs(基質(zhì)金屬蛋白酶)家族的重要一員,可降解細(xì)胞間質(zhì)和基底膜的主要成分Ⅳ型膠原,利于腫瘤細(xì)胞擺脫ECM的束縛進(jìn)行遷移[7]。研究發(fā)現(xiàn)COX-2過表達(dá)的腫瘤細(xì)胞可以通過激活VEGF,uPA和MMP-2以獲得侵襲的能力[8]。那么是否可以通過COX-2抑制劑選擇性抑制COX-2的表達(dá),從而抑制分泌型MMP-2的激活,達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞遷移擴(kuò)散的作用呢?

作者選擇COX-2陽性表達(dá)的人宮頸癌細(xì)胞株Hela作為研究對(duì)象。選擇低細(xì)胞毒性濃度的Celecoxib,即 30 μ mol/L、50 μ mol/L 作為基準(zhǔn)濃度。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察到塞來昔布聯(lián)合放射線可以明顯抑制Hela細(xì)胞的體外遷移能力,且隨藥物濃度增加,抑制能力增強(qiáng)。進(jìn)一步通過ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液中MMP-2的分泌水平發(fā)現(xiàn)D組較C 組,R+D 組較 R 組,R+D(50 μ mol/L)組較 R+D(30 μ mol/L)細(xì)胞 MMP-2 的分泌量均明顯下降(P<0.05),但R組較C組細(xì)胞MMP-2的水平并無明顯改變。有研究者認(rèn)為放療可引起MMP-2的表達(dá)增加,從而使放療后殘存腫瘤細(xì)胞的侵襲力增強(qiáng)[9]。作者的研究顯示放療后并未引起MMP-2的明顯改變,考慮與腫瘤細(xì)胞類型、放療劑量、放療后觀察細(xì)胞MMP-2水平的時(shí)間點(diǎn)不同等有關(guān)。

本次離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究顯示塞來昔布在較低細(xì)胞毒性濃度下聯(lián)合放射能夠抑制人宮頸癌細(xì)胞株Hela體外遷移力,具有濃度依賴性,其機(jī)制可能為抑制Hela細(xì)胞分泌型MMP-2的表達(dá)。綜上所述,塞來昔布有望成為用于提高宮頸癌放射治療療效、較少遠(yuǎn)地轉(zhuǎn)移的分子靶向藥物,但其確切機(jī)制尚需進(jìn)一步明確。

[1] 陳枝嵐,謝守珍,王 晶.宮頸癌根治術(shù)后近期并發(fā)癥的分析[J].華南國(guó)防醫(yī)學(xué)雜志,2010,25(1):82.

[2] 劉 軍,朱海杭,卜 平.環(huán)氧合酶-2在腫瘤預(yù)防與治療中的應(yīng)用進(jìn)展[J].實(shí)用癌癥雜志,2003,19(2):214.

[3] 陳壽松,陳昕薇,肖同浩,等.COX-2、PCNA、VEGF、和MVD在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其臨床意義[J].華南國(guó)防醫(yī)學(xué)雜志,2008,22(4):21.

[4] 李 盛.新輔助化療聯(lián)合放療治療局限性晚期宮頸癌的臨床療效觀察[J].局解手術(shù)學(xué)雜志,2011,20(2):185.

[5] 唐 郢,周 琦,舒小蕾,等.三維適形放射治療技術(shù)治療復(fù)發(fā)性宮頸癌的短期療效評(píng)估[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2009,31(17):1682.

[6] 趙麗琴.Celecoxib用于治療息肉在美國(guó)批準(zhǔn)上市[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)藥學(xué)分冊(cè),2000,27(5):319.

[7] Aharinejad S,Abraham D,Paulus P.Colony-stimulating factor-1 antisense treatment suppresses growth of human tumor xenografts in mice[J].Cancer Res,2002,62(18):5317.

[8] Li G,Yang T,Yan J.Cyclooxygenase-2 increased the angiogenic and metastatic potential of tumor cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2002,299(5):886.

[9] Zhao W,Goswami P C,Robbins M E.Radiation-induced up-regulation of MMP-2 involves increased mRNA stability,redox modulation,and MAPK activation[J].Radiat Res,2004,161:418.