抗人CD28激發(fā)性單抗對T細(xì)胞淋巴瘤的抑制作用研究①

胡玲玲 陳昌友 張益紅 郭靜雅 陸海波 旬神美 邱玉華

(南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗科,南京210011)

CD28分子是表達(dá)在T細(xì)胞表面的重要共刺激分子,是由兩條44 kD多肽鏈以二硫鍵連接而成的同源二聚體,為Ⅰ型跨膜糖蛋白,屬于免疫球蛋白超家族(IgSF)成員。CD28分子與B7-1或B7-2結(jié)合可為T細(xì)胞活化和增殖提供共刺激信號,從而引發(fā)免疫應(yīng)答[1]。鼠抗人CD28單克隆抗體2F5與T細(xì)胞表面CD28分子交聯(lián)形成多聚化后,產(chǎn)生類似于天然配基B7分子的作用,可促進(jìn)T細(xì)胞活化、增殖與分化,從而介導(dǎo)免疫效應(yīng)[2]。近年來,利用抗CD28單抗單獨(dú)或聯(lián)合抗CD3單抗或細(xì)胞因子IL-2等擴(kuò)增腫瘤特異性T細(xì)胞(CTL)的研究正日益深入[3-5]。腫瘤患者外周血單個核細(xì)胞(PBMC)與抗CD28單抗共培養(yǎng)后,Foxp3+Treg的比例下調(diào),提示該抗體能夠使腫瘤患者的免疫功能得到一定程度的恢復(fù)與提高[6]。研究表明,抗CD28特異性單鏈抗體可活化腫瘤特異性T細(xì)胞,進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增長[7]。本研究在已成功研制了鼠抗人CD28單克隆抗體的基礎(chǔ)上,觀察2F5對人惡性T淋巴瘤細(xì)胞株Jurkat體外增殖的抑制效果;建立裸鼠T淋巴細(xì)胞瘤動物模型,探討其對T淋巴瘤的體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑、儀器、細(xì)胞株及動物 鼠抗人CD28抗體2F5由本室研制并保存;PE標(biāo)記的羊抗鼠IgG(Fc;BD,美國);MTT(Sigma,美國);RPMI1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Gibco,美國);CO2培養(yǎng)箱、離心機(jī)(Jouan,法國);倒置顯微鏡 (Olympus,日本);流式細(xì)胞儀(Beckman-Coulter,美國);550型酶標(biāo)儀(Bio-rad,美國);人惡性 T淋巴瘤細(xì)胞株 Jurkat購自ATCC;BALB/c裸鼠(上海斯耐克動物中心,中國)。

1.2 鼠抗人CD28單抗 2F5對 Jurkat細(xì)胞膜型CD28分子的識別 收集生長良好的Jurkat細(xì)胞,用含1%BSA的PBS洗滌1次,調(diào)整細(xì)胞濃度至5×106ml-1,取100μl細(xì)胞懸液加到流式試管中,加入20μl 50mg/ml的鼠抗人CD28抗體混勻,4℃孵育40分鐘。PBS充分洗滌,加入PE標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗,4℃孵育40分鐘,用含1%BSA的PBS洗滌2次,將細(xì)胞重懸于300μl PBS溶液中,流式細(xì)胞儀分析。采用小鼠同型IgG抗體做對照。

1.3 CD28單抗對Jurkat細(xì)胞體外增殖的抑制作用

收集生長狀態(tài)良好的Jurkat細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度至2.0×106ml-1,100μl/孔加至96孔板。加入100 μl抗 CD28單抗(終濃度為 5 μg/ml),37℃、5%CO2分別培養(yǎng)24、48、72及96小時后,每孔加入20μl濃度為5 g/L的MTT,繼續(xù)培養(yǎng)4小時,離心棄上清后再加入100μl DMSO,震蕩混勻10分鐘,570 nm測定吸光度值。每組設(shè)置3個復(fù)孔,同時設(shè)置抗體同型對照和空白對照。抑制率=(同型對照組A值-實驗組A值)/同型對照組A值×100%。

1.4 Jurkat細(xì)胞荷瘤裸鼠模型的建立 取6周齡、雌性、體重為20～25克的BALB/c裸鼠41只。隨機(jī)選取35只接種1×107的Jurkat細(xì)胞于裸鼠左前肢腋下,接種當(dāng)天為第1天,逐日觀察并記錄腫瘤形成時間、成瘤率、腫瘤大小及裸鼠生存狀態(tài)等指標(biāo)。當(dāng)可以檢測到腫瘤時,用游標(biāo)卡尺測量腫瘤大小。腫瘤生長速度以成瘤潛伏期、荷瘤小鼠存活期和腫瘤結(jié)節(jié)大小來衡量。腫瘤結(jié)節(jié)體積:υ(mm3)≈(4/3π×長徑×短徑×高度)×1/8。剩余6 只未作任何處理,作為陰性對照,觀察裸鼠的生存狀態(tài)。

1.5 CD28單抗對Jurkat細(xì)胞荷瘤裸鼠的抑瘤作用

在無菌條件下,將抗CD28單抗稀釋到1μg/μl。選取16只荷瘤裸鼠隨機(jī)分成兩組,試驗組10只,陰性對照組6只,試驗組做剪耳標(biāo)記。首先用游標(biāo)卡尺測量荷瘤的長、寬 、高,荷瘤體積:V=4π/3×長 ×寬×高≈1/2(長×寬×高),然后采用瘤內(nèi)抗體多點(diǎn)注射方法,每mm3的瘤體注射1μg抗體。用藥后逐日觀察,每間隔7天測量裸鼠的腫瘤大小,并記錄荷瘤裸鼠生長狀態(tài)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析方法 所有統(tǒng)計分析在SAS(Statistical Analysis System,SAS Institute Inc.,Cary,NC)統(tǒng)計軟件中完成。服從正態(tài)分布的數(shù)值變量采用±s描述。在同一標(biāo)本的重復(fù)測量中,采用均數(shù)估計進(jìn)行點(diǎn)估計,并通過標(biāo)準(zhǔn)差反映儀器誤差的大小。在分析抗CD28抗體對瘤體生長的影響時,采用多水平模型處理重復(fù)測量的數(shù)據(jù),并考察組間效應(yīng)及時間趨勢。

2 結(jié)果

2.1 鼠抗人CD28單克隆抗體2F5對Jurkat細(xì)胞膜型CD28分子的識別 流式細(xì)胞儀分析結(jié)果表明,鼠抗人CD28單克隆抗體2F5可識別Jurkat細(xì)胞表面膜型CD28分子,陽型結(jié)合率可達(dá)93.37%,見圖1。

2.2 抗CD28單抗體對Jakurt細(xì)胞體外增殖的抑制作用 抗CD28單抗與Jurkat細(xì)胞共培養(yǎng)后,顯微鏡下觀察,48小時可見細(xì)胞有增殖現(xiàn)象,培養(yǎng)至96小時可見細(xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)黑色顆粒,細(xì)胞膜不完整或出現(xiàn)破裂,細(xì)胞的折光性和立體感減弱,呈現(xiàn)凋亡狀態(tài);而不加抗體組和同型對照組Jurkat細(xì)胞沒有出現(xiàn)凋亡狀態(tài)(圖2)。MTT法分析結(jié)果顯示,與同型對照組相比,抗CD28單抗對Jurkat細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用(圖3)。

2.3 Jurkat細(xì)胞荷瘤裸鼠的成瘤率及荷瘤情況 裸鼠接種第30天時,有24只長出清晰可見的腫瘤,成瘤率可達(dá)到70%。裸鼠在腫瘤成長期生長良好,健康,活躍。圖4為荷瘤裸鼠。

圖1 抗CD28單抗對Jurkat細(xì)胞表面CD28分子的識別Fig.1 Recognition of CD28 Mab with surface molecule CD28 on Jurkat cell

圖2 Jurkat細(xì)胞與小鼠2F5、小鼠IgG共培養(yǎng)以及空白對照組圖(×400)Fig.2 Jurkat cells cultured with 2F5,mouse IgG,and blank control(×400)

圖3 2F5對Jurkat細(xì)胞體外增殖的抑制作用Fig.3 Inhibition effect of 2F5 on proliferation of Jurkat cell in vitro

圖4 Jurkat細(xì)胞荷瘤裸鼠Fig.4 Naked mousebearing Jurkat tumor

表1 各時間點(diǎn)的組間腫瘤大小變化比較Tab.1 Comparison of change on tumor sizes between groups at each time-point

2.4 鼠抗人CD28單抗對Jurkat細(xì)胞荷瘤裸鼠的治療作用 CD28單抗經(jīng)瘤內(nèi)多點(diǎn)注射荷瘤裸鼠后,通過逐日觀察荷瘤裸鼠腫瘤的生長狀況,發(fā)現(xiàn)用藥組荷瘤裸鼠腫瘤直至第35天都沒有出現(xiàn)明顯的增殖現(xiàn)象,而同型對照組和陰性組卻出現(xiàn)了明顯的增殖狀況。采用多水平模型分析腫瘤大小的組間差異結(jié)果顯示,組間基線腫瘤大小差異有統(tǒng)計學(xué)意義(z=19.89,P=0.000 0),調(diào)整基線腫瘤大小后,組間差異仍然有統(tǒng)計學(xué)意義(z=4.89,P=0.000 0)。對照組自第21天起腫瘤明顯增大,而試驗組自第14天起明顯下降。對各時間點(diǎn)的腫瘤體積下降值進(jìn)行組間比較,采用Bonferroni法調(diào)整檢驗效能的結(jié)果顯示,自21天起,組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值皆為0.000 0)。見表1。

3 討論

T細(xì)胞瘤表面高表達(dá)CD28分子,本研究在自主研制了抗CD28激發(fā)性單抗2F5的基礎(chǔ)上,探討單抗2F5與T淋巴瘤表面的CD28分子結(jié)合后,對T細(xì)胞瘤增殖的抑制作用。把T淋巴瘤細(xì)胞株Jurkat與單抗2F5共培養(yǎng)48小時可見細(xì)胞有增殖現(xiàn)象,培養(yǎng)至96小時,顯微鏡下可見胞質(zhì)中出現(xiàn)黑色顆粒,胞膜破裂,細(xì)胞的折光性和立體感減弱。表明Jurkat細(xì)胞在與單抗2F5共培養(yǎng)的初期,可能由于單抗對細(xì)胞的激發(fā)作用,促進(jìn)細(xì)胞的增殖,但隨著培養(yǎng)時間的延長,對Jurkat細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用。

將Jurkat細(xì)胞接種于裸鼠腋下,建立Jurkat細(xì)胞荷瘤裸鼠模型。共接種35只裸鼠,其中24只長出清晰可見的腫瘤,成瘤率可達(dá)到70%。部分裸鼠未成瘤的原因可能為腫瘤細(xì)胞注射完成時細(xì)胞在針眼口溢出,致使注射的細(xì)胞數(shù)目減少而沒有生長腫瘤,還有一個原因可能為裸鼠具有一定的免疫能力。裸鼠在腫瘤成長期生長良好、健康、活躍。裸鼠長出了較大的腫瘤后,挑選10只經(jīng)瘤內(nèi)多點(diǎn)注射抗體,逐日觀察腫瘤的大小和裸鼠的生存狀態(tài),并每間隔7天進(jìn)行記錄。選取6只裸鼠注射生理鹽水作為陰性對照。經(jīng)抗體注射后的裸鼠,與對照組相比,腫瘤并未出現(xiàn)明顯的大小變化,因此認(rèn)為,裸鼠瘤內(nèi)局部注射單抗2F5,抑制了腫瘤的生長。另外,在剛剛注射抗體后對腫瘤有一定刺激作用,腫瘤略增大,隨后腫瘤則被抗體抑制出現(xiàn)減小。這與體外實驗結(jié)果相一致。而對照組老鼠腫瘤則出現(xiàn)較為明顯的增長。我們推測,荷瘤裸鼠經(jīng)CD28單抗2F5注射后,由于抗體對腫瘤細(xì)胞的抑制作用,因此腫瘤未出現(xiàn)明顯的增長。另假設(shè)荷瘤小鼠無免疫缺陷,由于單抗2F5可促進(jìn)T細(xì)胞活化、增殖與分化,從而激發(fā)機(jī)體對腫瘤的免疫應(yīng)答,對腫瘤的生長應(yīng)具有進(jìn)一步的抑制作用。國外也有報道,通過使用干擾素刺激機(jī)體對T細(xì)胞瘤進(jìn)行免疫應(yīng)答,從而治療皮膚T細(xì)胞淋巴瘤的案例[8]。

綜上所述,我們認(rèn)為鼠抗人CD28單克隆抗體2F5對Jurkat細(xì)胞的體內(nèi)外增殖具有明顯的抑制作用,可作為治療T細(xì)胞淋巴瘤的一個潛在新型生物藥物,為抗體介導(dǎo)的腫瘤靶向治療提供新的方法和思路。我們將對抗CD28單克隆抗體2F5抑制T細(xì)胞淋巴瘤增殖的機(jī)制進(jìn)行研究,為抗CD28單克隆抗體2F5進(jìn)一步的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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2 邱玉華,於葛華,陳永井 et al.激發(fā)型CD28單抗直接激發(fā)的細(xì)胞及其表型[J].上海免疫學(xué)雜志,2003;23(5):324-326.

3 Michael T,Gabriele H,ThomasH et al.CD28-induction of proliferation in resting T cells in vitro and vivowithout engagement of the T cell receptor:evidence for function distinct forms of CD28[J].Eur J Immunol,1997;27(1):239-247.

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