HPLC-ELSD測定天王補心丸中酸棗仁皂苷A的含量

何新榮，劉 萍，孫 艷(解放軍總醫(yī)院中藥房，北京 100853)

天王補心丸，主要成份為地黃、酸棗仁、麥冬、天冬、五味子等，主要功效為滋陰養(yǎng)血，補心安神。用于心陰不足，心悸健忘，失眠多夢，大便干燥[1]。天王補心丸處方中，酸棗仁養(yǎng)心安神[2]，而且酸棗仁及酸棗仁皂苷的安神藥理作用已有諸多報道[3，4]，但其制劑標準只對五味子醇甲進行了含量測定，為了更科學地控制天王補心丸的質(zhì)量，本文對其酸棗仁皂苷A的含量進行了測定，為其質(zhì)量控制提供科學有效的方法。

有關(guān)中藥飲片及其制劑中酸棗仁皂苷的含量測定已有較多報道[5-9]，但目前未見對天王補心丸中酸棗仁皂苷A含量的分析報道，本文采用HPLC-ELSD測定天王補心丸中酸棗仁皂苷A含量，方法快速簡便、穩(wěn)定可靠，適用于天王補心丸中酸棗仁皂苷A的定量分析及質(zhì)量標準的研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀(美國)，G1329A自動進樣器，數(shù)據(jù)由Agilent Chemstation on-line系統(tǒng)處理，蒸發(fā)光檢測器(ELSD，Alltech 3300)，色譜柱為 Agilent TC(2)-C18柱(250× 4.6 mm，5 μm)。電子天平 (Sartorius CP225D);KQ2200DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山超聲儀器);SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 試藥

酸棗仁皂苷A對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:110734-200407);天王補心丸(北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠，批號:8015117，8015079，9015317);甲醇(色譜醇);水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Agilent TC(2)-C18色譜柱(4.6 × 250 mm，5 μm，Agilent Technologies)，流 動 相 為 甲 醇-水 (梯 度 洗 脫)，流 速1.0 mL·min－1，柱溫:30℃;ELSD檢測霧化溫度45℃，氣體流速為 1.6 L·min－1。流動相:最初 5 min 為甲醇-水(70∶30)，5～30 min甲醇的濃度上升到80%并維持此比例5 min，3 min回到原始比例并平衡10 min。

2.2 標準曲線的制備

精密稱取酸棗仁皂苷A對照品2.25 mg，置于5 mL容量瓶中，加甲醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻即得0.45 mg·mL－1對照品貯備溶液。精密吸取對照品貯備溶液(0.1、0.2、0.4、0.8、1.6)mL定溶到2 mL，作為酸棗仁皂苷A標準品對照溶液，分別進樣20 μL測定。以酸棗仁皂苷A濃度為橫坐標(X)，峰面積的為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，得線性回歸方程為:lgY=1.324 9 lgX+0.239 2，r2=0.999 6(n=5)。結(jié)果表明，酸棗仁皂苷A在22.5～360 μg·mL－1范圍內(nèi)與峰面積的對數(shù)值呈良好的線性關(guān)系。

2.3 供試品溶液的制備

稱取天王補心丸(批號:8015079)，將大蜜丸剪碎、混勻，精密稱取10 g，加入兩倍量的硅藻土，研勻，精密稱定置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷至室溫，稱重并加甲醇至始重，搖勻，濾過，濾液作為供試品溶液，即得。其他兩個批次類此制備供試品溶液，備用。

2.4 陰性對照試驗

按天王補心丸制備工藝制備缺酸棗仁藥材的陰性樣品，并照“2.3”項下處理方法制成陰性對照品溶液，備用。供試品溶液、陰性對照品溶液，標準品對照溶液各20 μL分別進樣，結(jié)果表明，在與酸棗仁皂苷A對照品色譜峰(見圖1中圖C)相應位置上，供試品色譜圖中顯示相同保留時間的色譜峰;而陰性對照溶液在此保留時間處無色譜峰出現(xiàn)，表明陰性對照液無干擾，見圖1。

圖1 HPLC-ELSD色譜圖Fig 1 HPLC-ELSD chromatograms

2.5 精密度試驗

分別吸取對照品溶液和供試品溶液20 μL，按上述色譜條件，各重復進樣5次，測定峰面積積分值，計算RSD值。對照品溶液RSD=0.41%，供試品溶液RSD=1.08%。

2.6 重復性試驗

取同一批(批號:8015079，含量:0.271 8 mg·g－1)5 份，按照“2.3”項下依法平行制備供試品溶液，測定每份供試品中含量，結(jié)果平均值為0.271 2 mg·g－1，RSD=2.19%。表明其方法重現(xiàn)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

在室溫條件下，將2.3項下供試品提取液分別于提取后0、1、2、4、8、12(h)進樣 1 次，共測定 6 次，測得酸棗仁皂苷 A峰面積的RSD=2.00%，表明在12 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取已測知含量的同一批號的(批號:8015079，含量:0.271 8 mg·g－1)內(nèi)容物約1.0 g，共6份，精密稱定，分別加入精確吸取的2.2項下酸棗仁皂苷A標準貯備液0.5 mL(0.225 0 mg)、0.6 mL(0.270 0 mg)、0.7 mL(0.315 0 mg)，按照“2.3”項下制備供試品溶液，照上述高效液相色法測定，結(jié)果見表1。

表1 酸棗仁皂苷A加樣回收率試驗結(jié)果Tab 1 Results of recovery test of jujuboside A

2.9 樣品的測定

精密稱取3批天王補心丸樣品，每批取3份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進行分析，進樣量20 μL，測定酸棗仁皂苷A的峰面積積分值，用外標法計算酸棗仁皂苷A的含量，結(jié)果見表2。

表2 天王補心丸中酸棗仁皂苷A的含量(n=3)Tab 2 Content of jujuboside A in Tianwang Buxin pill samples(n=3)

3 討論

在供試品溶液的制備過程中，為了保證樣品中酸棗仁皂苷A的充分提取，本實驗考察了相關(guān)文獻[6-8]報道方法后，采用加入70%乙醇[6]、90%甲醇、100%甲醇超聲提取，并對不同提取時間進行了試驗，結(jié)果表明，70%乙醇與90%甲醇提取含量相當;100%甲醇超聲30 min，提取效果佳，無需復雜的提取工藝，較70%乙醇，90%甲醇提取完全。

本實驗采用HPLC-ELSD測定酸棗仁皂苷A的含量，其方法提取完全，簡便、快捷、穩(wěn)定，雜質(zhì)對分離無干擾，選擇性較強，為天王補心丸的質(zhì)量控制及含量測定建立一個可行的方法。同時，實驗中還對樣品中酸棗仁皂苷B進行了檢測(此條件下皂苷B對照品的保留時間為18.32 min)，可能由于其含量低[10]和ELSD檢測靈敏度限制，未能檢測出。

樣品檢測中，曾以不同比例的乙腈-水，甲醇-水，甲醇-0.1%醋酸，甲醇-0.2%醋酸為流動相等度和梯度洗脫，結(jié)果表明，以甲醇-水，甲醇-0.2%醋酸梯度洗脫時分離效果均較好，其他條件酸棗仁皂苷A的色譜峰形不好，故最終采用此流動相。與文獻[5，6]報道一致。

[1]國家藥典委員會．中華人民共和國藥典:一部[S]．北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:515.

[2]國家藥典委員會．中華人民共和國藥典·臨床用藥須知(中藥卷)[S]．北京:人民衛(wèi)生出版社，2005:475．

[3]陳百泉，杜鋼軍，許啟泰．酸棗仁皂苷的鎮(zhèn)靜催眠作用[J]．中藥材，2002，25(6):429.

[4]BAO Kang-De，LI Ping，LI Hui-Jun，et al．Simultaneous Determination of Flavonoids and Saponins in Semen Ziziphi Spinosae(Suanzaoren) by High Performance Liquid Chromatography with Evaporative Light Scattering Detection[J]．Chinese Journal of Natural Medicines，2009，7(1):47.

[5]陳 婧，劉焱文．HPLC-ELSD法測定酸棗仁湯中酸棗仁皂苷 A的含量[J]．中藥材，2006，29(7):730.

[6]張彥青，解軍波，張明春，等．HPLC-ELSD法測定酸棗仁滴丸中酸棗仁皂苷A、B和白樺脂酸[J]．中草藥，2009，40(2):234.

[7]李會軍，李 萍．高效液相色譜法蒸發(fā)光散射檢測器測定酸棗仁中酸棗仁皂苷A及B的含量[J]．藥物分析雜志，2000，20(2):82.

[8]隋 宏，周慧玲，陳建峰，等．HPLC-ELSD測定酸棗仁合劑中酸棗仁皂苷A的含量[J]．現(xiàn)代食品與藥品雜志，2007，17(6):35.

[9]張志斐，袁志芳，張?zhí)m桐，等．河北道地藥材酸棗仁HPLC-ELSD 指紋圖譜研究[J]．中草藥，2007，37(8):1247.

[10]古 今，劉 萍．HPCE法測定酸棗仁及其偽品中酸棗仁皂苷B的含量[J]．中國藥物應用與監(jiān)測，2007，4(5):38.