復(fù)方竹節(jié)參片對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎小鼠的抗炎作用

譚慶玲

湖北民族學(xué)院附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，湖北恩施 445000

復(fù)方竹節(jié)參片選用土家族名貴中草藥竹節(jié)參（為五加科植物竹節(jié)人參的干燥根莖）為主藥，配以淫羊藿、白芍、穿山龍等，經(jīng)濃縮提取，制備成的復(fù)方竹節(jié)參糖衣片劑型，臨床主要用于治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎以及跌打損傷等各類(lèi)風(fēng)濕疼痛病癥[1-2]。本文旨在研究復(fù)方竹節(jié)參片對(duì)小鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎（AA）的治療效果，并觀(guān)測(cè)AA小鼠血清細(xì)胞因子IL-6、IL-8、TNF指標(biāo)的變化情況，探討其對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎可能的作用機(jī)制及抗炎效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠（由湖北民族學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供），共48只，隨機(jī)將其分為4組，每組12只，其中，模型組（A組）體重（17.14±1.15）g， 雷公藤多苷片對(duì)照組 （B組） 體重 （18.05±1.20）g，復(fù)方竹節(jié)參片高劑量組（C 組）體重（18.14±1.17）g，復(fù)方竹節(jié)參片低劑量組（D 組）體重（18.09±1.19）g。 各組間體重等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 器材

TL-16G型高速離心機(jī)（上海實(shí)驗(yàn)儀器廠(chǎng)生產(chǎn)）；精密電子分析天平；容積測(cè)量?jī)x（自制）；GC-1200 r放射免疫計(jì)數(shù)器（安徽科大創(chuàng)新公司生產(chǎn)）；AXIOSKOP2PLUS光學(xué)顯微鏡（德國(guó)ZEISS公司生產(chǎn)）。

1.3 藥品

復(fù)方竹節(jié)參片（由湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院制劑室提供，批號(hào)：080915），制作方法：除去糖衣后粉碎，加水煎制成1∶2的濃縮液后過(guò)濾，于濾液中加入95%乙醇并攪拌，冷藏24 h后再過(guò)濾，回收乙醇溶液，并濃縮至每毫升含生藥2.0 g，最后高壓滅菌保存?zhèn)溆?；雷公藤多苷片（由湖北省黃石市制藥廠(chǎng)生產(chǎn)，批號(hào)：070，每片含雷公藤多苷10 mg）；弗氏完全佐劑；TNF、IL-8、IL-6試劑盒 （由中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院科技開(kāi)發(fā)中心放免所提供）。

1.4 方法

所有實(shí)驗(yàn)小鼠均按0.1 ml/只于左后足跖皮內(nèi)注射費(fèi)氏完全佐劑致炎，第8天開(kāi)始灌胃給藥，每日1次，連續(xù)21 d，其中，關(guān)節(jié)炎模型組（A組），每只給予生理鹽水0.200 ml，陽(yáng)性藥雷公藤多苷片對(duì)照組（B組）給藥劑量為0.020 g/kg，復(fù)方竹節(jié)參片高劑量組（C組）給藥劑量為6.000 g/kg，復(fù)方竹節(jié)參片低劑量組給藥劑量為3.000 g/kg。

1.5 小鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型的關(guān)節(jié)炎指數(shù)分級(jí)[3-4]

關(guān)節(jié)炎指數(shù)由輕到重評(píng)價(jià)：沒(méi)有紅腫為0級(jí)；足小趾關(guān)節(jié)紅腫為1級(jí)；趾關(guān)節(jié)和足跖部都紅腫為2級(jí)；踝關(guān)節(jié)以下均紅腫為3級(jí)；包括踝關(guān)節(jié)全部紅腫為4級(jí)。該實(shí)驗(yàn)從第一次免疫后的第7天開(kāi)始，每周評(píng)分1次。

1.6 指標(biāo)測(cè)定方法[5-6]

足爪體積測(cè)量采用排水法。復(fù)方竹節(jié)參片對(duì)病變的抑制作用以足爪腫脹抑制率為依據(jù)。耳廓腫脹模型采用二甲苯致小鼠耳廓腫脹，陽(yáng)性藥采用地塞米松（0.005 g/kg）。病變小鼠外周血IL-8、IL-6、TNF濃度采用放免法測(cè)定。小鼠踝關(guān)節(jié)繼發(fā)病變者，摘取做病理切片。病理學(xué)光鏡觀(guān)察軟骨破壞、骨侵蝕，以及關(guān)節(jié)滑膜組織、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS for Windows 10.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理測(cè)定結(jié)果

A組：踝關(guān)節(jié)骨質(zhì)疏松，滑膜充血、水腫呈不規(guī)則增厚，表面可見(jiàn)灶性壞死。踝關(guān)節(jié)發(fā)生明顯病變者，可見(jiàn)關(guān)節(jié)軟骨毛糙甚或缺損改變，軟骨細(xì)胞發(fā)生固縮，重者甚至形成軟骨空陷窩。滑膜內(nèi)可見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞、漿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)；B組、C組及D組：踝關(guān)節(jié)未見(jiàn)明顯病理改變，關(guān)節(jié)軟骨面光滑，僅見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，滑膜細(xì)胞輕度增生，但細(xì)胞排列整齊，形態(tài)規(guī)則。

2.2 復(fù)方竹節(jié)參片對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎小鼠足踝關(guān)節(jié)腫脹的影響

致炎后第2天，C組與D組足腫脹程度低于A組 （P＜0.05或P＜0.01）。與雷公藤多苷片相比，大劑量復(fù)方竹節(jié)參片更能抑制關(guān)節(jié)腫脹，表明大劑量復(fù)方竹節(jié)參片對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎小鼠原發(fā)病變的防治效果更顯著，并且優(yōu)于雷公藤多苷片，而低劑量組各時(shí)段對(duì)AA小鼠的影響不明顯。見(jiàn)表1。

表1 復(fù)方竹節(jié)參片對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎小鼠足踝關(guān)節(jié)腫脹的影響（，n=12）

表1 復(fù)方竹節(jié)參片對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎小鼠足踝關(guān)節(jié)腫脹的影響（，n=12）

注：與 A 組比較，*P＜0.05；**P＜0.01；與 B 組比較，△P＜0.05。

造模后不同時(shí)間小鼠右后足腫脹度（mm）第2天 第3天 第7天 第14天 第21天A組B組C組D組組別 劑量（g/kg）-0.0206.0003.0005.66±1.644.47±1.19*4.23±1.12**△4.16±1.08*6.63±1.185.23±1.14*5.12±1.46**△5.29±1.75*8.30±1.727.18±1.40*6.27±1.30**△7.40±1.41*11.11±1.659.30±3.00**8.71±2.11**△9.20±2.16*10.09±2.308.54±1.15**7.29±1.48**△8.20±2.16*

2.3 復(fù)方竹節(jié)參片對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響

復(fù)方竹節(jié)參片同地塞米松一樣，對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹具有明顯的抑制作用，且復(fù)方竹節(jié)參片劑量越大，抑制作用越明顯。見(jiàn)表2。

2.4 復(fù)方竹節(jié)參片對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎模型小鼠外周血細(xì)胞因子的影響

A組小鼠血清中 TNF、IL-6、IL-8水平與B組、C組、D組比較明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。灌服復(fù)方竹節(jié)參片或雷公藤多苷片一周后，病變小鼠血清中IL-6、IL-8水平降低（P＜0.05）。

表2 復(fù)方竹節(jié)參片對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響（，n=12）

表2 復(fù)方竹節(jié)參片對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響（，n=12）

注：與 A 組比較，**P＜0.01；與 D 組比較，ΔP＜0.05

A組地塞米松組C組D組組別 劑量（g/kg）-0.0056.0003.000腫脹值（ml）13.84±3.816.44±1.50**8.50±2.40**Δ 11.91±2.60

表3 復(fù)方竹節(jié)參片對(duì)AA小鼠外周血IL-6、IL-8、TNF 的影響（，n=12）

表3 復(fù)方竹節(jié)參片對(duì)AA小鼠外周血IL-6、IL-8、TNF 的影響（，n=12）

注：與 A 組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與 B 組比較，ΔP＜0.05

A組B組C組D組組別 劑量（g/kg）-0.0056.0003.000 IL-6（pg/ml）202.02±27.45158.41±33.60*137.50±34.09**Δ 134.85±23.00**Δ IL-8（ng/ml）1.77±0.201.30±0.16*1.05±0.44**Δ 1.15±0.50**Δ TNF（pg/ml）3.64±0.252.71±0.32*2.79±0.77*2.72±0.34*

3 討論

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）是以全身多處關(guān)節(jié)對(duì)稱(chēng)性慢性增生性滑膜炎癥為特征的免疫性疾病。以侵犯關(guān)節(jié)囊和關(guān)節(jié)軟骨為主而致關(guān)節(jié)強(qiáng)直畸形。弗氏完全佐劑誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎病理特征和人類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相似。復(fù)方竹節(jié)參片治療類(lèi)風(fēng)濕性、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)增生性、損傷性關(guān)節(jié)炎等[1]效果顯著，具有通絡(luò)止痛、益氣活血、溫腎壯骨、祛風(fēng)除濕的功效。復(fù)方竹節(jié)參片以竹節(jié)參為主要成分，閔靜[4]通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)竹節(jié)參通過(guò)降低血中炎性因子而起到明顯的抗炎作用。本試驗(yàn)表明復(fù)方竹節(jié)參和雷公藤片都能顯著改善實(shí)驗(yàn)小鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的腫脹程度，降低其關(guān)節(jié)炎指數(shù)，兩組比較差異不顯著。細(xì)胞因子為免疫細(xì)胞間的聯(lián)絡(luò)“信使”，維持免疫細(xì)胞功能的協(xié)調(diào)運(yùn)轉(zhuǎn)。本研究結(jié)果顯示，病變小鼠外周血中的TNF、IL-6、IL-8水平顯著升高，復(fù)方竹節(jié)參片能顯著抑制TNF、IL-6、IL-8的釋放，從而有助于抗炎因子和促炎因子間的平衡[7-8]，對(duì)降低組織破壞和減輕炎癥反應(yīng)有積極作用。同時(shí)復(fù)方竹節(jié)參片與雷公藤多苷片一樣能有效改善試驗(yàn)小鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，降低炎癥因子對(duì)軟骨和骨的侵蝕破壞，顯著改善AA小鼠的病變發(fā)展，同時(shí)，還能抑制IL-6、IL-8、TNF炎癥因子的病理性升高。

[1]陳龍全,張國(guó)安,何軍,等.復(fù)方竹節(jié)參片治療風(fēng)濕類(lèi)疾病218例臨床觀(guān)察[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,1998,9(5):391.

[2]徐叔云,卞如濂,陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].2版.北京:人民衛(wèi)生出版社,1997:183.

[3]張鈞田.現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)方法[M].北京:北京醫(yī)科大學(xué),中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社,1998:1383.

[4]閔靜.竹節(jié)參總皂苷抗炎機(jī)制的研究[J].咸寧學(xué)院報(bào):醫(yī)學(xué)版,2009,23(6):464-467.

[5]李振彬,段俊紅,沙海靜,等.燈盞花素對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的治療作用及其對(duì)滑膜MMP-3,TIMP-1表達(dá)的影響[J].河北中醫(yī),2007,29(1):63.

[6]張國(guó)恩,楊德華,錢(qián)玉中,等.痹康飲合劑治療大鼠膠原性關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)研究[J].中成藥,2006,28(5):690.

[7]胡家美.復(fù)方竹節(jié)參治療腰椎間盤(pán)摘除術(shù)后根性疼痛的臨床觀(guān)察[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2011,20(4):426-427.

[8]閔靜,敖明章,劉慧明,等.竹節(jié)參總皂苷對(duì)免疫器官的影響[J].湖北職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào),2008,11(1):109-111,105.