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    新藤黃酸固體脂質(zhì)納米粒的制備與質(zhì)量評(píng)價(jià)

    2011-07-28 05:25:38陳延杰陳衛(wèi)東
    中國(guó)藥業(yè) 2011年21期
    關(guān)鍵詞:藤黃甘油酯硬脂酸

    陳延杰,陳衛(wèi)東

    (安徽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,安徽 合肥 230038)

    固體脂質(zhì)納米粒(solid lipid nanoparticles)給藥系統(tǒng)是目前亞微粒給藥系統(tǒng)的發(fā)展熱點(diǎn)。它以生理相容的高熔點(diǎn)脂質(zhì)為骨架材料制備,將藥物包裹或內(nèi)嵌于類脂核中,制成粒徑約為50~1000 nm的固體膠粒給藥系統(tǒng),副作用小,室溫及體溫下呈固態(tài)粒子[1-2]。新藤黃酸(neo-gambogid acid)是從中藥藤黃中分離出的一種具有較高抗腫瘤活性的化合物,抗癌譜廣,對(duì)人肝癌細(xì)胞Bel-7402、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549、人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8以及人卵巢癌細(xì)胞A2780的增殖均有明顯抑制作用[3]。但新藤黃酸水溶性差,而且靜脈給藥時(shí)有強(qiáng)烈的血管刺激性,限制了其臨床應(yīng)用。此外,新藤黃酸在體內(nèi)的半衰期短,對(duì)治療效果也有很大的影響。結(jié)合臨床需求和目前制劑的發(fā)展情況,筆者將新藤黃酸藥制備成固體脂質(zhì)納米粒,控制粒徑大小,期望減小新藤黃酸的血管刺激性,提高體內(nèi)生物利用度,更好地發(fā)揮其藥理作用。

    1 儀器與試藥

    島津高效液相色譜儀(LC-20AB泵,SPD-M20A紫外檢測(cè)器及島津LC-solution色譜工作站);H-800型透射電子顯微鏡(日本日立公司);Delsa nano C型粒度分析儀(美國(guó)Beckman Coulter公司);UV-2550型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司);CP225D型電子天平(德國(guó)賽多利斯公司);85-2型恒溫磁力攪拌器(江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠);HH-S2型數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠)。新藤黃酸原料藥(安徽中醫(yī)學(xué)院藥化教研室提供);卵磷脂(安徽豐原藥業(yè)股份有限公司提供);泊洛沙姆188(德國(guó)BASF公司,批號(hào)為WO39846);單硬脂酸甘油酯(汕頭市西隴化工廠有限公司,批號(hào)為0906012);吐溫-80(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào)為F20050721);葡聚糖凝膠G-50(美國(guó)Pharmacia公司);其他試劑均為分析純。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 新藤黃酸固體脂質(zhì)納米粒制備

    取處方量的新藤黃酸、單硬脂酸甘油酯、卵磷脂溶于適量無(wú)水乙醇中,于(75±2)℃水浴下形成有機(jī)相。另取泊洛沙姆溶于蒸餾水中,加入少量吐溫-80,加熱至與有機(jī)相相同溫度,構(gòu)成水相。在攪拌過(guò)程中用針頭將有機(jī)相注入水相,按照每秒1滴的速度,整個(gè)過(guò)程中反應(yīng)溫度要保持在脂質(zhì)材料的熔點(diǎn)之上。攪拌1 h,待無(wú)水乙醇揮干,將所得的半透明體系快速分散于0~2℃的冰水中,并且冰浴攪拌30 min,即得納米粒混懸液。

    2.2 外觀與粒徑

    按照優(yōu)化后的處方制備樣品,將樣品用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的磷鎢酸溶液負(fù)染,然后滴至銅網(wǎng)上,室溫放置至形成薄膜后,用透射電子顯微鏡觀察。由圖1可見(jiàn),新藤黃酸固體脂質(zhì)納米粒為具有黃色乳光膠體溶液,電鏡下觀察納米粒為許多圓形或橢圓形球粒,平均粒徑為(113±6)nm。

    2.3 包封率測(cè)定

    2.3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

    精密稱取新藤黃酸2 mg對(duì)照品,用甲醇溶解稀釋,定容到10 mL容量瓶中,振搖作為新藤黃酸濃貯備液。以濃貯備液濃度配制質(zhì)量濃度為0.2 g/mL的新藤黃酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,同法配制空白溶液作參比,用紫外分光光度計(jì)于200~600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描,結(jié)果新藤黃酸在360 nm波長(zhǎng)處有最大吸收,故選擇360 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

    2.3.2 色譜條件

    色譜柱:Lichrospher C18柱(250 mm ×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:甲醇-0.1% 磷酸(9 ∶1);流速:1.0 mL/min;柱溫:25 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng):360 nm;進(jìn)樣量:20 μL。

    2.3.3 方法學(xué)考察

    專屬性試驗(yàn):取新藤黃酸對(duì)照品溶液、空白固體脂質(zhì)納米粒破乳溶液和新藤黃酸固體脂質(zhì)納米粒破乳溶液各20 μL進(jìn)樣分析,色譜圖見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示輔料對(duì)藥物含量測(cè)定無(wú)干擾。

    線性關(guān)系考察:精密吸取不同體積的貯備液,流動(dòng)相分別稀釋成 50,25,10,1.0,0.1μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別取 20 μL 進(jìn)樣,在按2.2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算峰面積。結(jié)果表明,以峰面積(A)為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度(C,μg/mL)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析,得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 A=30992 C-18289,r2=0.9995。

    圖1 透射電鏡圖

    圖2 高效液相色譜圖

    加樣回收試驗(yàn):按處方比例加入1 mL空白固體脂質(zhì)納米粒溶液至編號(hào)為 1,2,3的10 mL量瓶中,依次精確加入上述新藤黃酸貯備液 0.5,1,2 mL,以甲醇稀釋至刻度,得質(zhì)量濃度10~40μg/mL的樣品溶液,分別進(jìn)樣20μL,測(cè)定峰面積,連續(xù)3次,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成實(shí)際測(cè)定濃度,計(jì)算回收率。結(jié)果平均加樣回收率為99.3%,RSD為1.12%。

    精密度試驗(yàn):取同一新藤黃酸對(duì)照品溶液,連續(xù)進(jìn)樣5次,測(cè)定峰面積。結(jié)果峰面積的 RSD為1.02%,表明方法精密度良好。

    包封率測(cè)定[4]:以Sephadex G-50葡聚糖凝膠柱色譜法分離和游離藥物,測(cè)定其包封率。吸取1 mL新藤黃酸固體脂質(zhì)納米?;鞈乙荷现?,蒸餾水洗脫,收集帶有乳光部分的洗脫液,每2 mL收集1次,加甲醇并超聲破乳。另吸取1 mL新藤黃酸固體脂質(zhì)納米?;鞈乙?,直接加甲醇破乳并超聲提取。按2.3.2項(xiàng)下色譜條件分別測(cè)定兩樣品中新藤黃酸的含量,按公式包封率=m柱/m總計(jì)算包封率。m柱為新藤黃酸固體脂質(zhì)納米粒混懸液通過(guò)Sephadex G-50后測(cè)得的新藤黃酸的含量;m總為新藤黃酸固體脂質(zhì)納米?;鞈乙褐苯悠迫楹鬁y(cè)得的新藤黃酸的含量。按處方量進(jìn)行了3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn),制備 3批固體脂質(zhì)納米粒,得平均包封率為(60.1±1.1)%。

    2.4 正交試驗(yàn)與方差分析

    在單因素考察試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,確定單硬脂酸甘油酯(因素A)、泊洛沙姆用量(因素B)、乳化時(shí)間(因素C)、單硬脂酸甘油酯與卵磷脂比(因素D)4個(gè)因素,每個(gè)因素設(shè)定3個(gè)水平,進(jìn)行正交設(shè)計(jì)試驗(yàn),以包封率為考察指標(biāo)篩選最佳處方及工藝參數(shù)。因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1,試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2和表3??芍?,本試驗(yàn)4個(gè)因素影響程度為A>D>C>B,方差分析結(jié)果表明,A和B因素有顯著影響,初步確定最佳制備工藝為A2B1C1D3,即單硬脂酸甘油酯15 mg,泊洛沙姆濃度為0.8%,攪拌時(shí)間1 h,卵磷脂30 mg。

    表1 因素水平設(shè)計(jì)表

    2.5 工藝的驗(yàn)證與確定

    根據(jù)2.4項(xiàng)下確定的最優(yōu)處方和工藝條件平行制備3批載藥固體脂質(zhì)納米粒,分別測(cè)定其包封率和載藥量,確定乳化蒸發(fā)-低溫固化法的工藝流程,結(jié)果見(jiàn)表4。驗(yàn)證結(jié)果表明最佳處方重復(fù)性強(qiáng),包封率和載藥量保持穩(wěn)定。

    表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

    表3 方差分析結(jié)果

    2.6 納米粒粒徑與電位的測(cè)定

    取新藤黃酸固體脂質(zhì)納米?;鞈乙哼m當(dāng)稀釋后,用納米激光粒度儀測(cè)定粒徑及分布,結(jié)果見(jiàn)圖3、圖4。結(jié)果表明制得的平均粒徑為163.3 nm,粒徑大小相近,Zeta電位為-16.9 mV。

    表4 重復(fù)最佳處方制備的固體脂質(zhì)納米粒的包封率和載藥量(%)

    圖3 新藤黃酸固體脂質(zhì)納米粒粒度分布圖

    3 討論

    本試驗(yàn)采用高溫乳化-低溫固化法制備新藤黃酸固體脂質(zhì)納米粒,載體材料為單硬脂酸甘油酯和卵磷脂,表面活性劑以泊洛沙姆為主,吐溫-80為輔,兩者混合使用可得到比較理想的固體脂質(zhì)納米粒,控制粒徑在100~200 nm范圍內(nèi)。

    圖4 新藤黃酸固體脂質(zhì)納米粒Zeta電位圖

    單硬脂酸甘油酯的熔點(diǎn)在55℃左右,在制備過(guò)程中反應(yīng)溫度應(yīng)高于熔點(diǎn),最終確定反應(yīng)溫度為(75±2)℃ 。制備初乳時(shí),攪拌速率對(duì)反應(yīng)過(guò)程有較大的影響:攪拌速率過(guò)低,反應(yīng)不完全,有機(jī)溶劑揮發(fā)不完全,造成有溶劑殘留;而轉(zhuǎn)速過(guò)大,乳化時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量泡沫,影響表面活性劑的效果,最終確定轉(zhuǎn)速為1000 r/min。該方法固化的過(guò)程實(shí)際也是稀釋的過(guò)程,故所得混懸液的固體含量較低,粒子比較分散。

    試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),固體脂質(zhì)納米粒穩(wěn)定性不理想,放置一段時(shí)間后會(huì)有沉淀析出,可能是受周圍光線、溫度、濕度影響,造成晶型的改變[5],從β'轉(zhuǎn)變成β1,使晶格轉(zhuǎn)變,導(dǎo)致部分沉淀在混懸液中析出。期待進(jìn)一步試驗(yàn),將固體脂質(zhì)納米?;鞈乙鹤龀蓛龈煞?,以加強(qiáng)它的穩(wěn)定性。

    [1]Schwarz C,Mehner W,Lucks JS,et al.Solid lipid nanopartieles(SLN)for controlled drug delivery.Production,characterization and sterilization[J].Control Release,1994,30:83-96.

    [2]Zur Muhlen A,Schwarz C,Mehnert W.Solid lipid nanoparticles(SLN)for controlled drug delivery-drug release and release mechanism[J].Eur J Pharm Biopharm,1994,45:149-155.

    [3]程 卉,彭代銀,王效山,等.新藤黃酸體內(nèi)外抗腫瘤作用研究[J].中草藥,2008,3(2):236-240.

    [4]張 洪,詹新安,成 蓓,等.聯(lián)苯雙酯固體脂質(zhì)納米粒的制備[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào),2007,23(6):37-40.

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