空心蓮子草入侵對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其多樣性的影響

王志勇，江雪飛，鄭 慧，方治偉，鄭世學(xué)

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 微生物農(nóng)藥國家工程研究中心,湖北 武漢 430070；2.咸寧職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北 咸寧 437100)

空心蓮子草(Alternantheraphiloxeroides)，又名喜旱蓮子草、水花生、空心莧、水蕹菜、革命草，屬莧科，蓮子草屬，原產(chǎn)南美洲，多年生宿根、草本、水生植物，廣泛分布于溫帶及亞熱帶地區(qū)。1892年在我國首次發(fā)現(xiàn)，后來迅速蔓延。目前中國除甘肅東南部、寧夏、陜西、山西、內(nèi)蒙古南部以及遼寧南部尚未遭到入侵外，其它地區(qū)均有分布，2003年被中國科學(xué)院、中國環(huán)?？偩执_定為我國第一批外來入侵物種之一[1]。

空心蓮子草在其入侵過程中和本地植物及土壤微生物之間是一個(gè)動(dòng)態(tài)的相互作用過程，但從土壤微生物的角度分析空心蓮子草入侵的研究甚少。

變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)因可以分辨出長度相同但序列不同的DNA片斷，直接從樣品中擴(kuò)增出16S rDNA片斷，進(jìn)而分析群落結(jié)構(gòu)和多樣性[2]，在微生物生態(tài)學(xué)中得到了廣泛的應(yīng)用。作者在此擬通過對(duì)空心蓮子草入侵后土壤16S rDNA的DGGE分析，結(jié)合土壤理化性質(zhì)的分析、土壤酶活及可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量的變化來探討空心蓮子草入侵對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其多樣性的影響。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 樣品的采集與處理

采樣時(shí)間為2009年5月。所選采樣區(qū)分別為咸寧職業(yè)技術(shù)學(xué)院、仙桃職業(yè)學(xué)院、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，見表1。

表1 采樣地點(diǎn)的地理位置

3個(gè)采樣區(qū)同屬亞熱帶季風(fēng)性(濕潤)氣候，四季分明；年均氣溫為15.8～17.5 ℃，年均降雨量為1150～1450 mm，且較為集中。分別在空心蓮子草單一群落區(qū)和馬尼拉草坪區(qū)按五點(diǎn)采樣法采樣，采樣深度為0～15 cm，土樣充分混合后馬上風(fēng)干至濕度20%～30%，過2 mm篩子，一部分土樣立即用于土壤理化性質(zhì)和土壤酶活的測(cè)定，其余土樣-80 ℃保存，備用。

1.2 土壤理化性質(zhì)的分析

土壤pH值的測(cè)定采用電極法；土壤有機(jī)質(zhì)的測(cè)定采用重鉻酸鉀外加熱法；土壤全氮的測(cè)定采用半微量凱氏定氮法；土壤硝態(tài)氮的測(cè)定采用硝酸試粉法；土壤有效磷的測(cè)定采用鉬銻抗比色法；土壤速效鉀的測(cè)定采用四苯硼鈉比濁法；土壤含水量的測(cè)定采用常規(guī)的烘干稱重和風(fēng)干稱重的方法[3]。

1.3 土壤酶活的測(cè)定

脲酶活性測(cè)定采用靛酚蘭比色法[4]；脫氫酶活性測(cè)定采用2，3，5-氯化三苯基四氮(TTC)法[5]；酸性磷酸酶活性測(cè)定采用改進(jìn)后的Hoffman法[6]。

1.4 活菌計(jì)數(shù)

對(duì)各采樣點(diǎn)的混合土樣參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》，分別采用稀釋平板計(jì)數(shù)法，用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基測(cè)定土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌的數(shù)量[7]。

1.5 土壤總DNA的提取與純化

DNA提取方法參考純培養(yǎng)細(xì)菌總DNA提取方法，并根據(jù)實(shí)際情況加以調(diào)整：稱取0.5 g土樣于2 mL離心管，每管各加1 mL 2×Buffer A、10 μL 10 mg·mL-1蛋白酶K、20 μL 100 mg·mL-1溶菌酶，置于搖床上37 ℃、200 r·min-1振搖45 min(每隔15 min顛倒混勻)；每管加入125 μL 20% SDS溶液、60 μL CTAB、180 μL 5 mol·L-1NaCl，置于水浴鍋(65 ℃)水浴1 h(每隔15 min顛倒混勻)；室溫下8000 r·min-1離心10 min，將上清液平均轉(zhuǎn)入兩個(gè)新的1.5 mL離心管中；上清液中加入等體積苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1，體積比)，顛倒混勻，10 000 r·min-1離心5 min；將上清液轉(zhuǎn)入新的1.5 mL離心管中，加入等體積氯仿∶異戊醇(24∶1，體積比)，10 000 r·min-1離心5 min；將上清液轉(zhuǎn)入新的1.5 mL離心管中，加入0.6 BV異丙醇、0.1 BV pH值5.2的3 mol·L-1NaAc溶液，于4 ℃沉淀1 h；10 000 r·min-1離心20 min，倒去液體，倒扣于紙巾上晾干10 min，得到粗核酸；加入500 μL 70%乙醇溶液潤洗粗核酸，用微量移液器吹吸，10 000 r·min-1離心10 min；倒掉乙醇，在超凈臺(tái)上吹干乙醇，每管中加入10 μL ddH2O溶解沉淀，合并兩管土壤DNA，得到20 μL DNA溶液[8]。

用DNA純化試劑盒(DNA Fragment Purification Kit Mag Extractor，code：NPK-600)純化提取的總DNA，操作步驟按照說明書進(jìn)行。

1.6 16S rDNA的nested-PCR擴(kuò)增

第一次PCR：所用引物為27F/1492R(表2)。PCR擴(kuò)增體系：10×Buffer 2.5 μL，dNTPs 1 μL，27F 0.2 μL，1492R 0.2 μL，Taq酶0.2 μL，2.5 μL DNA(10 ng·μL-1)作為模板，以ddH2O補(bǔ)充至25 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性 5 min，94 ℃變性45 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸1.5 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

表2 16S rDNA nested-PCR引物

第二次PCR：所用引物為GC-968F/1401R(表2)，擴(kuò)增16S rDNA V6～V8可變區(qū)。GC-968F為968F的5′端接GC夾子(5′-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG-3′)。將第一次PCR產(chǎn)物按1∶100稀釋后作為擴(kuò)增模板。PCR擴(kuò)增體系：10×Buffer 2.5 μL，dNTPs 1 μL，GC-968F 0.2 μL，1401R 0.2 μL，Easy酶0.2 μL，Template 0.5 μL，以ddH2O 補(bǔ)充至25 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，66 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，使所有片段完全延伸[9～11]。產(chǎn)物約為430 bp。

1.7 16S rDNA nested-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的DGGE

將純化后的nested-PCR產(chǎn)物用BIO-RAD公司DCodeTMSystem梯度凝膠電泳儀進(jìn)行DGGE。丙烯酰胺/雙丙烯酰胺凝膠(37.5∶1)為40%，電泳緩沖溶液為1×TAE，膠濃度為8%，變性梯度為50%～60%。點(diǎn)樣量為第二次PCR產(chǎn)物20 μL，電泳電壓60 V、溫度60 ℃、時(shí)間16 h，然后固定、銀染、照膠[10，11]。

1.8 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

DGGE圖譜的分析用Quantity One軟件進(jìn)行，各數(shù)據(jù)的方差分析、單因素分析、數(shù)據(jù)差異性分析用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件、Excel軟件進(jìn)行，用OriginPro 7.5和Excel軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 空心蓮子草入侵對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響(表3)

從表3可以看出，采自咸寧、武漢酸性土樣的pH值下降顯著(P<0.05)。廖全斌等[12]在研究空心蓮子草吸收鈷離子前后溶液pH 值的變化時(shí)指出：在堿性條件下pH值增大，表明有生物堿溶于水中； pH值減小可能與該植物對(duì)重金屬離子的吸收機(jī)制有關(guān)。正常情況下空心蓮子草既會(huì)向土壤中釋放生物堿，也要從土壤中吸收金屬離子，其吸收機(jī)制也應(yīng)該是生物吸附，因此多種因素之和可以引起酸性土壤pH值的下降。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果與其一致。

表3 空心蓮子草入侵對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

從表3還可以看出，空心蓮子草入侵后3個(gè)采樣區(qū)土壤的全氮含量均增加，硝態(tài)氮含量顯著或極顯著增加；采自咸寧、仙桃土樣的有效磷和有機(jī)質(zhì)的含量均顯著或極顯著增加，而采自武漢土樣的有機(jī)質(zhì)和有效磷含量顯著或極顯著下降；采自咸寧、武漢土樣的有效鉀含量下降極顯著，而采自仙桃土樣的有效鉀含量則顯著增加。

2.2 空心蓮子草入侵對(duì)土壤酶活性和可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量的影響(表4)

表4 空心蓮子草入侵對(duì)土壤酶活性和可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量的影響

從表4可以看出，空心蓮子草入侵后，土壤脲酶的活性均顯著增大，其中采自咸寧、仙桃土樣的脲酶活性極顯著增大；采自咸寧、武漢的這兩組偏酸性土樣的脫氫酶活性和酸性磷酸酶活性下降顯著，而采自仙桃的偏堿性土樣的脫氫酶活性顯著增大、酸性磷酸酶活性極顯著增大。

從表4還可以看出，空心蓮子草入侵后，3個(gè)采樣區(qū)土壤的可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量均顯著增加。

2.3 空心蓮子草入侵對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和細(xì)菌多樣性的影響

用細(xì)菌16S rDNA第二次PCR產(chǎn)物進(jìn)行DGGE，結(jié)果見圖1。

圖中上方1～6為：XN、XNAp、XT、XTAp、WH、WHAp，下方的數(shù)字代表相應(yīng)泳道的Shannon-Weaner Index H′

從圖1可以看出，各泳道的條帶數(shù)目、條帶位置和亮度存在一定程度的差異。如圖1中左向的箭頭1、2、3、4、6是入侵后減少或減弱的條帶，右向的箭頭5是入侵后加強(qiáng)的條帶。而所有入侵地區(qū)土壤細(xì)菌的Shanon-Wiener Index均下降。這表明空心蓮子草入侵后引起了土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的改變，細(xì)菌多樣性因土壤的差異呈不同的下降趨勢(shì)。

2.4 討論

養(yǎng)分的獲得對(duì)入侵植物的生長、擴(kuò)張有決定的作用。牛紅榜[13]在對(duì)紫莖澤蘭入侵的研究中發(fā)現(xiàn)：紫莖澤蘭的入侵提高了土壤中植物可直接吸收的硝態(tài)氮、銨態(tài)氮等速效養(yǎng)分的含量，紫莖澤蘭和當(dāng)?shù)刂参锏姆敝程匦耘c利用速度不同，因此土壤速效養(yǎng)分的提高可能對(duì)紫莖澤蘭的生長和競(jìng)爭(zhēng)有利。本研究中空心蓮子草入侵后土壤全氮和硝態(tài)氮的含量顯著增加。土壤中氮素的來源主要有施肥、灌溉、降水、生物固定等幾種方式。由于本研究采樣區(qū)各區(qū)域內(nèi)的自然條件相同，管理人員對(duì)所在區(qū)域草坪的施肥、灌溉等操作基本一致，由此可以認(rèn)為土壤氮素的增加主要來自生物固定。作為植物而言，空心蓮子草本身不具備固氮的能力，因此可以認(rèn)為空心蓮子草入侵后可能引起了土壤固氮微生物數(shù)量的增加或者活性的提高，從而提高了土壤的氮素含量。土壤中氮素循環(huán)的一般過程是土壤有機(jī)質(zhì)首先經(jīng)過微生物的水解然后氨化形成銨態(tài)氮，在旱地中由于通氣條件較好，這些銨態(tài)氮會(huì)很快被氧化成硝態(tài)氮，即經(jīng)土壤微生物的硝化作用轉(zhuǎn)變成硝態(tài)氮[14]。本研究中空心蓮子草入侵后土壤硝態(tài)氮含量均顯著增加，可能是參與土壤硝化作用的微生物數(shù)量增加所致。

土壤酶活性是土壤的本質(zhì)屬性之一。土壤中的酶主要來源于微生物、動(dòng)物、植物活體的分泌及這些生物殘?bào)w的分解和釋放(其中微生物的作用更大)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，空心蓮子草入侵后，土壤胞外酶脲酶[15]的活性顯著增強(qiáng)，可能是產(chǎn)生脲酶的微生物數(shù)量增加所致。因此，空心蓮子草入侵后，可能促進(jìn)了與土壤氮素循環(huán)有關(guān)的微生物數(shù)量的增加，這些微生物包括與氮素固定的相關(guān)微生物、與氮素轉(zhuǎn)化有關(guān)的微生物如參與硝化作用(主要是硝化細(xì)菌)、分泌脲酶的微生物的數(shù)量增加，使得土壤中氮素的代謝變得更加活躍，進(jìn)而使得土壤中空心蓮子草可利用的氮素含量增加，從而更利于空心蓮子草的生長?；罹?jì)數(shù)的結(jié)果表明，空心蓮子草入侵后土壤可培養(yǎng)細(xì)菌的數(shù)量均顯著增加，也間接說明空心蓮子草入侵引起了土壤酶活性的變化。

同紫莖澤蘭的入侵類似，空心蓮子草的生長速度也非?？?。據(jù)觀察，空心蓮子草在適宜自然條件下，旱地每15 d內(nèi)枝條平均長度可增加6.76 cm，覆蓋面積增加54.9 m2[16]。該植物的快速生長需要大量的營養(yǎng)元素特別是氮素的支持，因此土壤全氮含量增加、硝態(tài)氮含量顯著增加可能是空心蓮子草成功入侵的重要因子。相關(guān)性分析表明，可培養(yǎng)細(xì)菌的數(shù)量與硝態(tài)氮含量之間的相關(guān)系數(shù)為0.90，為極顯著正相關(guān)(P<0.01)，可能是空心蓮子草的入侵引起了土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌特別是硝化細(xì)菌數(shù)量的增加，從而導(dǎo)致土壤硝態(tài)氮含量顯著增加；土壤全氮含量與土壤脲酶活性之間的相關(guān)系數(shù)為0.78，為顯著正相關(guān)(P<0.05)，這可能是由于土壤全氮含量的增加促進(jìn)了能分泌脲酶的微生物的活性。

3 結(jié)論

通過比較空心蓮子草入侵前后土壤理化性質(zhì)、土壤酶活、可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量及16S rDNA的PCR-變性梯度凝膠電泳(DGGE)發(fā)現(xiàn)，空心蓮子草入侵后，硝態(tài)氮含量、土壤脲酶活性和可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量顯著增加，可培養(yǎng)細(xì)菌的數(shù)量與硝態(tài)氮含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)；土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定程度的改變，細(xì)菌的多樣性指數(shù)因土壤不同而呈現(xiàn)不同的下降趨勢(shì)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 陳立立，余巖，何興金．喜旱蓮子草在中國的入侵和擴(kuò)散動(dòng)態(tài)及其潛在分布區(qū)預(yù)測(cè)[J]．生物多樣性，2008，16(6)：578-585.

[2] Muyzer G，Wall D E，Uitterlinden A G.Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction amplified genes coding for 16S rRNA[J].Appl Environ Microbiol，1993，59(3)：695-700.

[3] 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)．土壤農(nóng)化分析(第二版)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2005：27-90.

[4] 豐驍，段建平，蒲小鵬，等．土壤脲酶活性兩種測(cè)定方法的比較[J]．草原與草坪，2008，(2)：70-72.

[5] 解軍，祁峰，裴海燕，等．脫氫酶活性檢測(cè)方法及其在環(huán)境監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用[J]．中國環(huán)境監(jiān)測(cè)，2006，22(5)：13-18.

[6] 趙蘭坡，姜巖．土壤磷酸酶活性測(cè)定方法的探討[J]．土壤通報(bào)，1986，16(3)：138-141.

[7] 沈萍，范秀寬，李廣武，等．微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]．北京：高等教育出版社，2004：92.

[8] Sun H Y，Deng S P，Ruan W R.Bacterial community structure and diversity in a century-old manure-treated agroecosystem[J].Appl Environ Microbiol，2004，70(10):5868-5874.

[9] DeLong E F.Archaea in coastal marine environments[J].Proc Natl Acad Sci USA，1992，89(12):5685-5689.

[10] Nübel U，Engelen B,Felske A,et al.Sequence heterogeneities of genes encoding 16S rRNAs inPaenibacilluspolymyxadetected by temperature gradient gel electrophoresis[J].Bacteriology,1996，178(19)：5636-5643.

[11] Muyzer G，Smalla K.Application of denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE)and temperature gradient gel electrophoresis(TGGE) for studying soil microbial communities[J].Antonie van Leeuwenhoek，1998，73(1)：127-141.

[12] 廖全斌，羅光富，童開發(fā)，等．空心蓮子草吸附鈷離子前后溶液pH值的變化及其紅外光譜研究[J]．三峽大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2002，24(3)：286-288.

[13] 牛紅榜．外來植物紫莖澤蘭入侵的土壤微生物學(xué)機(jī)制[D]．北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2007.

[14] 范業(yè)寬，葉坤合．土壤肥料學(xué)[M]．武漢：武漢大學(xué)出版社，2002：61-62.

[15] 吳金水，林啟美，黃巧云，等．土壤微生物生物量測(cè)定方法及其應(yīng)用[M]．北京：氣象出版社，2006：117-120.

[16] 周志華，曹茂華，王成，等．旱地空心蓮子草自然消長規(guī)律及在農(nóng)田中的分布和侵染擴(kuò)展速度調(diào)查[J]．現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2008，37(22)：112-113.