甲狀旁腺激素對(duì)人牙囊前體細(xì)胞核因子κB受體激活因子配體和骨保護(hù)素mRNA表達(dá)的影響

荊曉艷，賈 智，劉大勇，趙夢(mèng)明

(天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院，天津 300070)

牙齒萌出過(guò)程受許多因素的調(diào)節(jié)，包括細(xì)胞和 細(xì)胞因子間的相互作用。牙囊前體細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子如巨噬細(xì)胞集落刺激因子－1(CSF－1)、單核細(xì)胞趨化蛋白－1(MCP－1)、骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)、上皮生長(zhǎng)因子(EGF)、核因子 κB受體激活因子配體(receptor activator of nuclear fac-tor kappa－B ligand，RANKL)等，不僅有促進(jìn)單核細(xì)胞募集的作用，還可促進(jìn)其分化為破骨細(xì)胞，使牙槽骨吸收形成牙齒萌出通道，是牙齒萌出的重要調(diào)控物質(zhì)［1－2］。近年來(lái)又有研究發(fā)現(xiàn)，牙胚萌出過(guò)程中甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)與相應(yīng)受體結(jié)合發(fā)生障礙時(shí)，牙槽骨不G能吸收形成萌出道，說(shuō)明PTH也是一種不可缺少的重要細(xì)胞調(diào)節(jié)因子［3－5］。PTH主要由成釉器星網(wǎng)狀層細(xì)胞分泌，與臨近的牙槽骨和牙囊間充質(zhì)中的受體結(jié)合，調(diào)控細(xì)胞的分化。PTH與牙囊前體細(xì)胞分泌的促牙槽骨吸收的細(xì)胞因子間的相互作用尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)體外培養(yǎng)人牙囊前體細(xì)胞，觀察PTH對(duì)RANKL和OPG mRNA表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

重組人甲狀旁腺激素1－84(上海起福生物科技有限公司);α－MEM培養(yǎng)液(Hyclone公司，美國(guó));優(yōu)級(jí)胎牛血清(PAA公司，德國(guó));胰蛋白酶(Gibco公司，美國(guó));引物(上海生工);TransZol Up、TransScript Two－Step RT－PCRsuperMix、DNA marker(全式金，北京);瓊脂糖、梯度PCR儀(MJ Research公司，美國(guó))，倒置顯微鏡和照相系統(tǒng)(O-lympus公司，日本)，凝膠成像分析儀(Vitbertourmat公司，法國(guó))。

1.2 人牙囊前體細(xì)胞的體外培養(yǎng)和純化

選擇12～15歲因正畸治療需要拔除第三磨牙的病人，取其埋伏阻生的下頜第三磨牙的牙囊組織，立即置預(yù)冷的含100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素的PBS液中保存(4 h內(nèi)用于實(shí)驗(yàn))。在超靜工作臺(tái)內(nèi)將牙囊組織用PBS液反復(fù)沖洗后，剪成0.5mm ×0.5mm ×0.5 mm 大小的組織塊，均勻置于直徑35 mm的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，再置37℃、50mL/L CO2孵箱中，4 h后加入1 mL含100 mL/L胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素的α－MEM培養(yǎng)液，3 d后半量換液，待細(xì)胞由組織塊爬出后每3 d更換1次培養(yǎng)液，15 d后細(xì)胞融合，用含 EDTA 為0.2 mg/mL的2.5 mg/mL胰蛋白酶液消化，并按1∶2進(jìn)行傳代。利用細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶消化時(shí)間的不同，以排除混雜的上皮細(xì)胞，達(dá)到純化牙囊前體細(xì)胞的目的，約傳代2次即可純化細(xì)胞，取第3～5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。在此期間，每日均用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3 RT－PCR檢測(cè)PTH作用下人牙囊前體細(xì)胞RANKL、OPG mRNA 的表達(dá)

1.3.1 人牙囊前體細(xì)胞的處理

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第4代人牙囊前體細(xì)胞，用含0.2 mg/mL EDTA的2.5 mg/mL的胰蛋白酶溶液消化后，制成單細(xì)胞懸液，以2×103/cm2接種到直徑為60 mm的培養(yǎng)皿，待細(xì)胞融合達(dá)80%左右后，進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。

1.3.1.1 不同濃度PTH對(duì)人牙囊前體細(xì)胞的作用

取上述培養(yǎng)的人牙囊前體細(xì)胞，分為4個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，4個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別加入含PTH終末濃度為0.1、1、10、100 ng/mL 的 α － MEM 培養(yǎng)液;對(duì)照組加不含PTH的α－MEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)2 h后去原培養(yǎng)液，PBS沖洗3次，加入1 mL TransZol使細(xì)胞充分裂解后，再按以下步驟提取總RNA:0.2 mL氯仿劇烈渦旋抽提分層，10000 r/min 4℃離心15 min，取無(wú)色水相上層，0.5 mL異丙醇析出沉淀，10000 r/min4℃離心10 min，棄上清，用1 mL無(wú)RNA酶的750 ml/L乙醇洗滌沉淀，5000 r/min 4℃離心5 min，棄上清，室溫干燥形成膠狀沉淀，將膠狀沉淀充分溶于10 μL RNA溶解液后，取出1 μL稀釋100倍，用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定280 nm和260 nm處的吸光度值(OD)，以評(píng)定其濃度和純度。然后再根據(jù)測(cè)定值調(diào)整RNA標(biāo)本濃度為 1 μg/μL。

1.3.1.2 100 ng/mL PTH 刺激不同時(shí)間對(duì)人牙囊前體細(xì)胞的作用

取上述培養(yǎng)的人牙囊前體細(xì)胞，分為不用PTH刺激的空白對(duì)照組、100 ng/mL PTH刺激2、4、8 h組，分別于加樣培養(yǎng)各時(shí)間點(diǎn)去原培養(yǎng)液，PBS沖洗3次，加入1 mL TransZol使細(xì)胞充分裂解后，按1.3.1.1 RNA 提取步驟提取總 RNA。

1.3.2 人牙囊前體細(xì)胞cDNA第一鏈合成和多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)

采用TransScript Two－Step RT－PCR superMix試劑盒。cDNA第一鏈合成20 μL體系:總RNA，50 ng～ 5 μg(5 ～ 500 ng);Anchored Oligo(dt)18(0.5 μg/μL)1μL;2 × TS Reaction Mix，10 μL;Trans-Script RT/RI Enzyme Mix，1 μL，Rnase－free Water to 20 μL。PCR 擴(kuò)增 RANKL、OPG 和內(nèi)參 GAPDH:OPG引物序列:上游引物:5'－CACAAATTGCAGTGTCTTTGGT － 3'，下游引物:5'－AGGTGAGGTTAGCATGTCCAAT－3'，產(chǎn)生 386 bp的 cDNA片段;RANKL引物序列:上游引物:5'－ATCACAGCACATCAGAGCAGAG－3＇，下游引物:5'－GGACAGACTCACTTTATGGGAACC－3'，產(chǎn)生 126 bp 的 cDNA 片段。GAPDH引物序列:上游引物:5'－GTCAGTGGTGGACCTGACCT － 3'，下 游 引 物:5＇－AGGGGAGATTCAGTGTGGTG－3'，產(chǎn)生413 bp的 cDNA片段。PCR 25 μL 反應(yīng)體系:cDNA，1 μL;上游引物1 μL;下游引物 1 μL;2 × TransTaqTMHiFi PCR SuperMixⅡ，12.5 μL;ddH2O，8.5 μL。反應(yīng)條件為:94 ℃ 變性5 min后，94 ℃變性30 sec，OPG56℃RANKL、GAPDH 58℃退火 30 sec，72℃延伸 1 min，35個(gè)循環(huán)，后72℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物行溴化乙啶染色(EB染色)瓊脂糖凝膠電泳，觀察，照相。

1.3.3 灰度值分析

用Quantity One軟件進(jìn)行灰度值分析，以樣品灰度值與同一樣品GAPDH的灰度值之比作為評(píng)價(jià)RANKL、OPG表達(dá)量的指標(biāo)，采用軟件繪制折線圖觀察比較兩基因的表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

以上均為5次獨(dú)立重復(fù)的實(shí)驗(yàn)，所得數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行方差分析，兩兩比較用SNK－q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 牙囊前體細(xì)胞的培養(yǎng)和純化

牙囊前體細(xì)胞組織塊法原代培養(yǎng)5 d左右可見(jiàn)部分組織塊周圍有細(xì)胞呈放散狀爬出，大部分細(xì)胞為長(zhǎng)梭形或紡錘形，呈成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，少部分呈多角形或不規(guī)則三角形，還可見(jiàn)到部分混雜的立方形扁平細(xì)胞，7 d后可見(jiàn)組織塊周圍細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，去除組織塊后，約14～20 d左右細(xì)胞融合達(dá)80%，利用細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶消化時(shí)間的不同，經(jīng)兩次傳代后細(xì)胞形態(tài)基本為成纖維樣或多角形(圖1)，細(xì)胞得到純化。

圖1 體外培養(yǎng)的人牙囊前體細(xì)胞

2.2 不同濃度PTH對(duì)人牙囊前體細(xì)胞RANKL和OPG mRNA表達(dá)的影響

隨著 PTH 濃度(0.1、1、10、100 ng/mL)增高，牙囊前體細(xì)胞RANKL mRNA的表達(dá)量逐漸增加，OPG mRNA的表達(dá)量逐漸降低，且不同濃度PTH作用各組之間RANKL和OPG mRNA的表達(dá)量均有顯著差異(P ＜0.05)(圖2～3，表1)。

圖2 不同濃度PTH作用下RANKL mRNA和OPG mRNA的表達(dá)

圖3 不同濃度PTH作用下RANKL mRNA和OPG mRNA的相對(duì)灰度值比較

表1 不同濃度PTH作用下RANKL mRNA和OPG mRNA的相對(duì)灰度值()

表1 不同濃度PTH作用下RANKL mRNA和OPG mRNA的相對(duì)灰度值()

不同字母為各濃度組間P＜0.05

PTH濃度(ng/mL)RANKL/GAPDH OPG/GAPDH A 0.0 0.164 ±0.0114A 0.678 ±0.00840.1 0.184 ±0.0114B 0.356 ±0.0114B 1.0 0.206 ±0.0152C 0.342 ±0.0084C 10.0 0.386 ±0.0182D 0.328 ±0.0084C 100.0 0.582 ±0.0109E 0.284 ±0.0089D

2.3 100 ng/mL PTH作用不同時(shí)間對(duì)人牙囊前體細(xì)胞表達(dá)RANKL和OPG mRNA的影響

RANKL mRNA隨PTH作用時(shí)間增加表達(dá)量逐漸增加，OPG mRNA的表達(dá)量逐漸減低。且不同的作用時(shí)間下RANKL和OPG mRNA的表達(dá)量均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)(圖4～5，表2)。

圖4 RANKL mRNA和OPG mRNA在PTH(100 ng/mL)不同作用時(shí)間的表達(dá)

圖5 RANKL mRNA和OPG mRNA在PTH(100 ng/mL)不同作用時(shí)間的相對(duì)灰度值比較

表2 PTH作用不同時(shí)間RANKL mRNA和OPG mRNAp的相對(duì)灰度值()

表2 PTH作用不同時(shí)間RANKL mRNA和OPG mRNAp的相對(duì)灰度值()

不同字母為各時(shí)間點(diǎn)之間P＜0.05

作用時(shí)間(h)RANKL/GAPDH OPG/GAPDH 00.376 ±0.0114A 0.804 ±0.0089A 0.502 ±0.0083B 0.514 ±0.0089B 40.566 ±0.0114C 0.300 ±0.0070C 80.710 ±0.0100D 0.234 ±0.00542 D

3 討論

牙齒的萌出是一個(gè)復(fù)雜而且受到嚴(yán)密調(diào)控的過(guò)程［6］，在此過(guò)程中既有牙槽骨、牙胚的組織學(xué)改變，也有牙囊前體細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞等細(xì)胞學(xué)的改變，并且有多種細(xì)胞因子參與，其中破骨細(xì)胞的分化、活化、牙槽骨的吸收是牙齒萌出的關(guān)鍵。

許多研究［7］表明牙囊前體細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子可調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的形成和牙槽骨的吸收，其中主要有巨噬細(xì)胞集落刺激因子－1(CSF－1)、單核細(xì)胞趨化蛋白－1(MCP－1)、RANKL和OPG等。金作林等［8－9］研究表明，牙齒萌出過(guò)程中牙囊前體細(xì)胞分泌的促破骨細(xì)胞分化因子之間有相互影響和作用，如 IL－10，TNF－α，BMP－2 等。

甲狀旁腺激素(PTH)是重要的鈣平衡調(diào)節(jié)激素，與口腔頜面部發(fā)育和牙齒發(fā)育密切相關(guān)。現(xiàn)已了解PTH與破骨細(xì)胞的分化有著不可分割的作用，但破骨細(xì)胞上并無(wú)PTH受體［10］，PTH主要通過(guò)成骨細(xì)胞介導(dǎo)的OPG－RANKL－RANK系統(tǒng)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞生成。骨保護(hù)素(OPG)是 Tsuda等［11］(1997)發(fā)現(xiàn)的一種骨代謝因子，屬于腫瘤壞死因子受體超家族中的一員，由成骨細(xì)胞－基質(zhì)細(xì)胞合成，是生理性的抑制破骨細(xì)胞性骨吸收的因子。RANKL是腫瘤壞死因子受體配體超家族成員11(TNFSF 11)，由317個(gè)氨基酸殘基組成，屬Ⅱ型跨膜蛋白，在體內(nèi)以膜結(jié)合型和可溶性羧基末端兩種形式存在，兩種類型均可與餌受體OPG結(jié)合而失去生物學(xué)活性，OPG與RANKL之間競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合是調(diào)控破骨細(xì)胞分化、增殖、凋亡以及發(fā)揮生理作用的最重要的途徑。

Inaam A.Nakchbandi等［12］研究發(fā)現(xiàn):牙囊前體細(xì)胞少量表達(dá)Ⅰ型PTH受體，在牙齒萌出的過(guò)程中作為靶細(xì)胞介導(dǎo)破骨細(xì)胞的形成。也有體外研究表明［13］PTH以劑量依賴和時(shí)間依賴方式下調(diào)胎鼠顱蓋骨成骨細(xì)胞中OPG基因表達(dá)，同時(shí)上調(diào)RANKL基因的表達(dá)。牙囊是牙齒萌出不可缺少的部分，牙囊前體細(xì)胞表達(dá)OPG和RANKL，參與調(diào)節(jié)牙齒萌出時(shí)牙槽骨的吸收。本研究對(duì)體外培養(yǎng)的人牙囊前體細(xì)胞給予了不同濃度和不同作用時(shí)間的PTH刺激，檢測(cè)RANKL和OPG mRNA的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)PTH可下調(diào)人牙囊前體細(xì)胞OPG的表達(dá)，上調(diào)RANKL的表達(dá)，推測(cè)PTH可能在局部環(huán)境中與牙囊前體細(xì)胞和成骨細(xì)胞結(jié)合，通過(guò)反比例調(diào)節(jié)RANKL和OPG mRNA的表達(dá)，使破骨細(xì)胞前體細(xì)胞向骨吸收區(qū)域聚集，促進(jìn)其融合成多核破骨細(xì)胞，引起牙槽骨吸收，參與牙齒萌出道的形成。

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