右歸飲對(duì)激素性股骨頭壞死氧化應(yīng)激途徑相關(guān)基因表達(dá)的影響研究

姜月艷 方劍利 毛 強(qiáng) 童培建

股骨頭壞死是激素在臨床廣泛應(yīng)用后被公認(rèn)的主要并發(fā)癥之一，目前激素性股骨頭壞死的發(fā)病率已經(jīng)超過(guò)了外傷所致的股骨頭壞死［1，2］。激素性股骨頭壞死的發(fā)病機(jī)制尚未被完全闡明，目前主要存在的學(xué)說(shuō)有骨質(zhì)疏松學(xué)說(shuō)、脂肪栓塞學(xué)說(shuō)、血管病變學(xué)說(shuō)、骨內(nèi)高壓學(xué)說(shuō)等［3～5］。但尚無(wú)一能明確闡釋其確切病機(jī)病程［6］。所以臨床對(duì)SINFH也缺乏相應(yīng)特異有效的藥物［7］。

隨著基因技術(shù)的發(fā)展，對(duì)SINFH的病機(jī)研究逐漸深入到細(xì)胞分子機(jī)制和基因?qū)用妫?，9］。現(xiàn)在越來(lái)越多的研究顯示，氧化應(yīng)激在SINFH的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起作用，而與氧化應(yīng)激相關(guān)的基因在SINFH的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中亦有不同程度的表達(dá)［10，11］。那么是否可以通過(guò)抑制氧化應(yīng)激而達(dá)到防治SINFH的目的呢?于是就這一設(shè)想我們進(jìn)行了本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究，希望可以借此為中藥防治SINFH提供一點(diǎn)思路。

材料與方法

1.材料:(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:成年健康Wistar大鼠20只，雌雄各半，體重200±10g;喂食大鼠普通飼料。于清潔級(jí)環(huán)境中飼養(yǎng)，正壓屏障系統(tǒng)，空氣經(jīng)過(guò)3級(jí)過(guò)濾，空氣潔凈度達(dá)萬(wàn)級(jí);24h循環(huán)光照，自由攝食飲水，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)籠飼養(yǎng)5只。以上實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、飼料及設(shè)施均由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。(2)實(shí)驗(yàn)試劑和儀器:大腸桿菌內(nèi)毒素 L2880(美國(guó)Sigma公司);甲潑尼龍(美國(guó)Pfizer公司);多聚甲醛(天津市化學(xué)試劑研究所);中性甲醛緩沖溶液(衢州巨化有限公司);Prime-ScriptTM RT reagent試劑盒(日本 TaKaRa公司);BioEasy SYBR GreenⅠReal Time PCR試劑盒(中國(guó)Bioer Technology公司)、Leica RM2016切片機(jī)(德國(guó)Leica公司);櫻花全封閉組織脫水機(jī)(日本SAKURA公司);Microm EC350模塊化組織包埋機(jī)(德國(guó)Thermo公司)。(3)右歸飲制備:稱取30倍量處方，加1L水浸泡1h后，加10倍水于密閉式高壓自動(dòng)煎藥鍋內(nèi)煎煮，提取1.5小時(shí)/次，提取2次;所得提取液趁熱過(guò)四層紗布后合并，放冰箱內(nèi)冷藏12h后，以4000r/min，3℃下離心15min，共2次。合并上清液，加熱至沸騰，趁熱放置冰箱內(nèi)冷藏12h后，再以4000r/min，3℃下離心15min，共2次，合并上清液，濃縮到密度為1.35g/ml，于60℃減壓干燥。干燥物碾細(xì)，過(guò)120目篩子后得到右歸飲細(xì)粉。

2.方法:(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型制備:20只 Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，精確稱重，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型對(duì)照組和右歸飲治療組，每組10只。兩組大鼠均按2μg/100g劑量經(jīng)腹腔注射大腸桿菌內(nèi)毒素2次，每次間隔24h。最后1次注射大腸桿菌內(nèi)毒素24h后，再按4mg/100g劑量經(jīng)左側(cè)臀肌注射甲潑尼龍，連續(xù)注射3次，每次間隔24h。最后一次注射甲潑尼龍24h后，模型對(duì)照組予以蒸餾水1ml/100g灌胃，每天1次，共6周。右歸飲治療組:按1ml/100g劑量右歸飲灌胃，每天1次，共6周。(2)標(biāo)本制備:于第6周末采集左側(cè)股骨頭標(biāo)本。大鼠稱重后，按4ml/kg劑量腹腔注射水合氯醛，麻醉成功后，依次固定，備皮，消毒。嚴(yán)格無(wú)菌手術(shù)下迅速取出連同大小轉(zhuǎn)子在內(nèi)的左側(cè)股骨頭，盡量除去周圍軟組織后，肉眼觀察股骨頭形態(tài)、關(guān)節(jié)軟骨色澤及外形(由專人記錄)，再?gòu)墓跔蠲媲虚_，其中一半經(jīng)焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate，DEPC)水漂洗后立即投入液氮中保存，用于基因芯片檢測(cè)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)和免疫組化檢測(cè);另一半投入100g/L多聚甲醛溶液中保存，用于組織病理學(xué)觀察。(3)組織病理學(xué)觀察:本研究主要通過(guò)HE染色對(duì)所取標(biāo)本進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。具體方法如下:將所取標(biāo)本置于體積分?jǐn)?shù)為10%的中性甲醛溶液(0.1mol/L，pH7.4)中固定3天，然后置于100g/L EDTA－Tris緩沖液中脫鈣，每周更換脫鈣液1次，以大頭針能無(wú)阻力刺進(jìn)骨密質(zhì)為完全脫鈣標(biāo)準(zhǔn)。脫鈣完全后，再逐級(jí)脫水，二甲苯透明，石蠟包埋切片，沿冠狀位切片，切片厚度為4μm，切片后行常規(guī) HE染色，光鏡下觀察。(4)基因芯片檢測(cè):此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)操作委托上海晶泰生物技術(shù)有限公司操作完成?；蛐酒瑱z測(cè)數(shù)據(jù)見表1。(5)基因芯片數(shù)據(jù)驗(yàn)證:主要運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)。具體方法如下:實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法:選定基因芯片發(fā)現(xiàn)的下調(diào)表達(dá)基因Gclc、SOD3和COX6A2，用同一RNA樣品，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，對(duì)基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證。采用兩步法完成實(shí)時(shí)熒光定量PCR整個(gè)檢測(cè)過(guò)程。先將提取出的總RNA(0.5μg)應(yīng)用 PrimeScriptTMRT reagent試劑盒，通過(guò) Thermo-ScriptTMreverse transcriptase(RT)－PCR System合成 cDNA。合成的cDNA(2μl)采用BioEasy SYBR GreenⅠReal Time PCR試劑盒通過(guò)real－time PCR(ABIPRISM 7000)進(jìn)行擴(kuò)增。設(shè)立看家基因β－actin作為內(nèi)參，與目的基因在同一條件下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。結(jié)果通過(guò)序列檢測(cè)軟件(ABIPRISM 7000)獲得。特定基因引物根據(jù)GenBank公布的序列，應(yīng)用Primer Express(Applied Biosystems CA，USA)軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)。并由上海生工生物技術(shù)有限服務(wù)公司合成引物，各引物具體序列見表2?；虮磉_(dá)水平以β－actin表達(dá)水平進(jìn)行校正。在相對(duì)定量分析中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果以Ct值顯示，Ct值為每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，Ct值越大，表達(dá)量越低。平均△Ct值為樣本目的基因的平均Ct值減去β－actin的平均Ct值。用模型對(duì)照組的平均△Ct值為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算出右歸飲治療組的2－△△Ct，以2－△△CT代表目的基因的相對(duì)表達(dá)水平［6］。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用兩組獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組樣本均數(shù)比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究中，表達(dá)倍數(shù)變化2倍以上的基因數(shù)據(jù)經(jīng)We1ch T－test分析(P＜0.01)即確定為顯著差異表達(dá)基因。

表1 模型對(duì)照組及右歸飲治療組基因芯片數(shù)據(jù)差異譜

結(jié) 果

1.組織病理學(xué)觀察結(jié)果:(1)標(biāo)本肉眼大體觀察:1)模型對(duì)照組:軟骨表面不光滑、色晦暗，部分皺縮，軟骨厚度明顯變薄，有部分軟骨表面剝脫、成臺(tái)階樣改變、軟骨下骨裸露和軟骨脫落后的部分肉芽變。2)右歸飲治療組:軟骨表面尚光滑、有光澤，部分皺縮，軟骨厚度變薄，未見軟骨表面剝脫。(2)組織病理學(xué)觀察:1)模型對(duì)照組:股骨頭結(jié)構(gòu)完整，軟骨細(xì)胞排列紊亂，軟骨基質(zhì)不均勻，在軟骨表面有纖維結(jié)締組織的增生，出現(xiàn)片狀軟骨鈣化，潮線斷續(xù)或消失，鈣化帶與軟骨下骨小梁斷裂或不連續(xù)。骨壞死區(qū)骨髓的病變特征為大片灶性或彌漫性骨髓壞死、溶解、滲出，髓內(nèi)小血管變性、壞死，非壞死區(qū)骨髓基本為脂肪細(xì)胞所取代，骨髓內(nèi)造血組織數(shù)目減少或接近消失，髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞增大，有的融合呈泡狀;骨細(xì)胞腫大，細(xì)胞核受壓變形、邊聚，有的胞核固縮、溶解、碎裂，空虛骨陷窩增多。骨壞死區(qū)主要集中在軟骨下區(qū)，可見壞死骨小梁間隙纖維組織增生，包繞骨小梁，內(nèi)有大量充血擴(kuò)張的血管或靜脈竇，多核破骨細(xì)胞出現(xiàn)，未見新生骨沉積，軟骨下小血管明顯減少(圖1)。2)右歸飲治療組:股骨頭結(jié)構(gòu)完整，軟骨基底層灶性變性，軟骨細(xì)胞排列不規(guī)則，軟骨基質(zhì)不均勻，可見片狀軟骨鈣化，潮線部分?jǐn)嗬m(xù)，鈣化帶與軟骨下骨小梁斷裂或不連續(xù)。骨小梁板層樣結(jié)構(gòu)稀疏但較為整齊，骨小梁邊緣成骨細(xì)胞多見，軟骨下血管豐富。部分骨小梁內(nèi)骨細(xì)胞數(shù)減少，散在細(xì)胞核固縮，核深染，出現(xiàn)少量骨陷窩空虛。骨細(xì)胞核大居中，有空虛骨陷窩，但較模型組少，髓腔內(nèi)造血細(xì)胞較豐富，散在的骨髓細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊或細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失，呈淡染的粉紅色區(qū)域，局部紅骨髓壞死(圖2)。

2.基因芯片檢測(cè)結(jié)果:基因芯片檢測(cè)結(jié)果顯示模型對(duì)照組與右歸飲治療組相比氧化應(yīng)激相關(guān)基因中有32條基因的表達(dá)存在差異，其中18條表達(dá)上調(diào)，14條表達(dá)下調(diào)。經(jīng)分析，這些差異表達(dá)基因中有3條基因的表達(dá)存在顯著差異，且都成下調(diào)表達(dá)，見表2。這3條基因的功能分別涉及抑制ROS的生成、增加ROS的清除以及保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷等方面。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果:選取基因芯片篩選出的3條明顯差異基因(Gclc、SOD3和COX6A2)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證，結(jié)果見表3。

表3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果比較(△CT值，)

表3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果比較(△CT值，)

與模型對(duì)照組相比右歸飲治療組的Gclc、SOD3、COX6A2基因mRNA的表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)?？梢娀蛐酒瑱z測(cè)結(jié)果與RT－PCR檢測(cè)結(jié)果相符。

討 論

生物體內(nèi)的自由基主要為氧自由基(oxygen derived freeradicals，OFR)。這些氧自由基以及由它們衍生的單線態(tài)氧(O2)、過(guò)氧化氫(H2O2)和脂質(zhì)過(guò)氧化物(RO－、OO－與ROOH)等，統(tǒng)稱為活性氧(reactive oxygen species，ROS)［12，13］。細(xì)胞內(nèi)的 ROS有多種來(lái)源，許多細(xì)胞內(nèi)的酶促化學(xué)反應(yīng)途徑均生成ROS。除線粒體呼吸鏈外，內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合酶(eNOS)、還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶、細(xì)胞色素P450氧化酶、黃嘌呤氧化酶、環(huán)氧化酶和脂氧合酶催化的反應(yīng)均伴有活性氧的產(chǎn)生［14］。

新近研究表明氧化應(yīng)激幾乎參與了生物體所有疾病的發(fā)病過(guò)程，其參與機(jī)制主要包括引起血管損傷和細(xì)胞凋亡［15～18］。亦有研究表明血管損傷參與了SINFH的發(fā)病過(guò)程，而細(xì)胞凋亡也被認(rèn)為是SINFH的發(fā)病機(jī)制之一［15～23］。因此，可推測(cè)氧化應(yīng)激參與了SINFH的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。另一方面，臨床上在治療SINFH時(shí)運(yùn)用的一些抗氧化應(yīng)激藥物(如他汀類藥物 statins，ACEI類，TZDs，CCB 等)也都取得了一定療效，這也反證了氧化應(yīng)激在SINFH的發(fā)病過(guò)程中起作用［24，25］。目前關(guān)于中醫(yī)藥防治SINFH的研究也越來(lái)越多，右歸飲作為中醫(yī)補(bǔ)腎的經(jīng)典名方，將其運(yùn)用于SINFH大鼠模型后，其對(duì)SINFH大鼠股骨頭組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定影響(表現(xiàn)為股骨頭結(jié)構(gòu)較模型對(duì)照組完整，骨小梁板層樣結(jié)構(gòu)也較模型對(duì)照致密整齊，空骨陷窩率遠(yuǎn)低于模型對(duì)照)。研究的主要思路是嘗試從分子生物學(xué)角度闡明右歸飲抗氧化應(yīng)激進(jìn)而防治SINFH的分子機(jī)制。本研究運(yùn)用基因芯片技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了3個(gè)右歸飲抗氧化應(yīng)激相關(guān)顯著差異基因(Gclc、SOD3和COX6A2)，提示此3個(gè)基因可能是SINFH發(fā)病的關(guān)鍵基因［26～28］。本研究為研究SINFH的發(fā)病機(jī)制及其防治提供了一個(gè)新的角度，在此基礎(chǔ)上，可進(jìn)一步運(yùn)用其他基因技術(shù)(如基因敲除、基因?qū)氲?來(lái)探討SINFH的發(fā)病機(jī)制及行之有效的防治方法，并最終戰(zhàn)勝SINFH。

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