內(nèi)皮祖細(xì)胞研究進(jìn)展

鄭 睿 姚建民

隨著人們生活水平的不斷提高，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的發(fā)病率正逐年提高，其已經(jīng)轉(zhuǎn)變?yōu)槟壳皣?yán)重危害人類健康的三大主要疾病之一。目前的主要治療方法有內(nèi)科藥物治療、經(jīng)皮冠脈支架置入術(shù)(PCI)、激光心肌再血管化、冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)(CABG)。盡管近期發(fā)現(xiàn)的新生鼠心肌細(xì)胞可以完全再生［1］的研究結(jié)果一定程度上打破了以往認(rèn)為的心肌細(xì)胞是一種終末分化細(xì)胞、缺乏再生能力的觀點(diǎn)，但是對(duì)于成人來說，上述舊觀點(diǎn)依然成立，一旦發(fā)生不可逆的大量缺血性壞死，勢必導(dǎo)致相應(yīng)區(qū)域的心肌細(xì)胞被纖維結(jié)締組織所替代，從而導(dǎo)致心功能的降低。冠狀動(dòng)脈血供的重建是治療心肌梗死最有效和最根本的方式，但是，面對(duì)患者中病變較重、遠(yuǎn)端血管完全閉塞、血管纖細(xì)的情況，上述治療方式所能提供的血運(yùn)重建效果明顯不足。因此，為了縮小心肌梗死發(fā)生后的梗死面積，更加有效地重建缺血心肌的血供，近年來逐漸開展的細(xì)胞移植技術(shù)為我們展現(xiàn)出了一片治療方式的新天地。因此，關(guān)于探索更進(jìn)一步改善心肌梗死患者預(yù)后的治療方式已經(jīng)成為目前極為迫切的問題。

一、內(nèi)皮祖細(xì)胞的基礎(chǔ)研究現(xiàn)狀

以往，血管生成(vasculargenesis)是指中胚層源性的前體細(xì)胞原位分化為成血管細(xì)胞(angioblast)，繼而分化為內(nèi)皮細(xì)胞形成原始毛細(xì)血管網(wǎng);而血管新生(angiogenesis)被定義為，機(jī)體或組織受胚胎發(fā)育過程或出生后血流增加的需要而從已存的血管以一種出芽的方式發(fā)生的毛細(xì)血管分支。在內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cell，EPC)被發(fā)現(xiàn)以前，血管生成普遍被認(rèn)為只存在于早起胚胎的發(fā)生過程中。但自從1997年Asahara［2］報(bào)道了一組異源性的骨髓源性CD34+細(xì)胞可以分化為內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cell，EC)后，出生后血管生成的存在便被證實(shí)以及廣泛的接受了。之前，細(xì)胞因子的應(yīng)用已經(jīng)被證實(shí)能夠增強(qiáng)組織的新生血管(neoangiogenesis)的生成［3］，但是，考慮到存在于循環(huán)血中的EPC數(shù)量非常稀少，而這一問題可能已經(jīng)限制了細(xì)胞因子應(yīng)用，因此，一系列基于EPC的血管生成功能的動(dòng)物或臨床實(shí)驗(yàn)已經(jīng)展開，目前在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)初步證實(shí)了其潛在的治療效果［4］。

在 Asahara的發(fā)現(xiàn)后不久，Shi［5］報(bào)道了一種與前者發(fā)現(xiàn)的EPC具有相似功能的細(xì)胞群，他們有著相似的抗原決定簇，但是兩者的形態(tài)及增殖卻有著明顯的不同。這前后的兩種細(xì)胞日后被分別稱為早期EPC(early EPC)和晚期 EPC(late EPC)［6］。相繼的報(bào)道，雖然冠以內(nèi)皮集落形成細(xì)胞(endothelial colonyforming cell，CFU－EC)和內(nèi)皮細(xì)胞集落形成單位(endothelial cell colony－forming unit，ECFC)的稱呼，但實(shí)質(zhì)上也更進(jìn)一步的支持了有關(guān)于EPC的這一分類［7］。

由于造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cell，HSC)和EPC同時(shí)表達(dá)某些細(xì)胞表面抗原(表1)，許多研究人員嘗試著去尋找HSC和EPC之間的可能聯(lián)系。目前比較明確的是，依賴于不同的細(xì)胞培養(yǎng)條件，成血管細(xì)胞(hemangioblast)有向造血系或者內(nèi)皮系分化的雙向分化能力［8］，因此，上述兩種細(xì)胞有著共同的前體細(xì)胞——成血管細(xì)胞。但研究人員并不局限于此種結(jié)果，他們開展了更深一步的探索。但是后續(xù)研究結(jié)果眾說紛紜，基于CFU－HILL分析，有人指出其為造血源性，或更有之歸為單核細(xì)胞源性［7，9，10］;也有人指出 EPC 并非源于 HSC［7，11，12］。當(dāng)然，針對(duì)Rehman等的研究，他們得出了相當(dāng)有說服力的關(guān)于EPC的單核細(xì)胞起源的抗原表形分析結(jié)果，但是我們認(rèn)為其中關(guān)于細(xì)胞的連續(xù)4天的培養(yǎng)可能沒有考慮到移除早期能夠貼壁的成熟內(nèi)皮細(xì)胞及單核細(xì)胞，才導(dǎo)致了其關(guān)于EPC起源的如此確定的結(jié)果，或者說對(duì)其來源的一種誤解［13］。但是，CD11b+/VRGFR1+細(xì)胞確實(shí)參與到了腫瘤的新生血管中及其周圍［14］，因此，我們依然對(duì)此質(zhì)疑。當(dāng)然，從另一個(gè)方面來看這個(gè)問題，上述明顯不同的結(jié)果顯然證實(shí)了EPC不同亞單位的存在，即我們可以理解為不同的分離方法造成的有相似功能的不同亞單位造成了上述截然不同的關(guān)于EPC起源的結(jié)果。更有一些研究人員認(rèn)為，對(duì)于早期EPC應(yīng)該有著更進(jìn)一步的分類，認(rèn)為早期EPC依然屬異源細(xì)胞群，其中包括CD34+/CD45+(CD133+)造血干/祖細(xì)胞及 CD45+/CD14+單核細(xì)胞［7，12］。所以，為內(nèi)皮祖細(xì)胞冠以單一的稱呼EPC可能導(dǎo)致了不同研究的有爭議的結(jié)果，其中血管生成所募集的各個(gè)組分的混合顯然不利于研究的可重復(fù)性，往往導(dǎo)致了我們的錯(cuò)誤結(jié)論。

表1 分離常用的特異性標(biāo)志

Lyden［14］的研究結(jié)果顯示，把載有VEGF的基質(zhì)膠種植到1天突變小鼠體內(nèi)(實(shí)驗(yàn)前接受了野生型小鼠骨髓移植處理)，發(fā)現(xiàn)其恢復(fù)了其體內(nèi)具有功能的血管的形成，可見β－半乳糖苷酶陽性的VEGFR2+內(nèi)皮祖細(xì)胞及β－半乳糖苷酶陽性的VEGFR1+/CD11b+髓系細(xì)胞。這兩類細(xì)胞的生成也從一個(gè)側(cè)面支持了我們上面的模型。

盡管有著上述的不確定因素，但是根據(jù)Lin［11］的結(jié)論，有一點(diǎn)我們可以肯定，即EPC來源于骨髓。這樣，結(jié)合上文的依據(jù)及對(duì)EPC的兩個(gè)亞集的分類［6］，我們做如下假設(shè):早期EPC來源于造血系，主要起分泌細(xì)胞因子輔助晚期EPC的功能，而晚期EPC來源于生血管細(xì)胞(angioblast)系，主要起血管生成的作用(圖1)。這一假設(shè)與 Yoder［15］提出的工作模型相比具有一致性，并且更符合我們目前所公認(rèn)出生后的血管生成過程。同時(shí)，在其工作模型中亦涉及到了由不同功能細(xì)胞構(gòu)成的EPC，他將其分為造血細(xì)胞及高(或低)增殖潛力的內(nèi)皮集落形成細(xì)胞(high/low proliferation potential endothelial colony forming cells，HPP－ or LPP－ECFC)。

圖1 EPC的衍化途徑

許多研究者指出，骨髓源性的內(nèi)皮祖細(xì)胞對(duì)于成人新生脈管系統(tǒng)的相對(duì)貢獻(xiàn)目前存在著諸多的爭議，似乎很大程度上取決于所采用的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，具有很大的不定性，范圍大概從較小的貢獻(xiàn)到50%左右的貢獻(xiàn)，甚至于起絕對(duì)主要的作用［14，16～19］。因此，盡管像Yoder所說，他們提出的模型更符合傳統(tǒng)觀點(diǎn)的血管新生，而不是新認(rèn)識(shí)到的關(guān)于出生后的血管生長的血管生成，但是我們認(rèn)為很可能是實(shí)驗(yàn)對(duì)象的基因背景、原發(fā)或移植腫瘤、新生血管過程中的不同時(shí)相等問題導(dǎo)致了EPC對(duì)于成人新生脈管系統(tǒng)的貢獻(xiàn)比例不同［17，19］。因此，我們及Yoder提出的模型可能同時(shí)存在于體內(nèi)，根據(jù)不同的內(nèi)環(huán)境或條件分別起主要或次要的作用。

二、表面標(biāo)志

由于缺少區(qū)別與其他細(xì)胞群的特異性的表面標(biāo)志及功能性分析(例如成熟內(nèi)皮細(xì)胞及造血細(xì)胞)，有關(guān)EPC的純化及特性的研究在很大程度上受到了限制。盡管EPC用于再生醫(yī)學(xué)或腫瘤學(xué)治療中的靶細(xì)胞的潛能一再被眾多文獻(xiàn)所證明，但是其中具有爭議性的臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦不斷出現(xiàn)［20～24］，我們認(rèn)為這可能是由于以下一些未明確的問題所造成的，即EPC的分離、鑒定、特性等等。為了解決這些質(zhì)疑以往骨髓移植觀點(diǎn)的爭議性結(jié)果，首當(dāng)其沖的就是如何準(zhǔn)確地分離出大家所公認(rèn)的內(nèi)皮祖細(xì)胞。

目前，從外周血分離EPC共存在3種不同的方法。前兩種基于培養(yǎng)細(xì)胞的差速貼壁原理，在3種方法中得到了最為廣泛的應(yīng)用。在具體步驟中，第一步的單個(gè)核細(xì)胞(mononuclear cell，MNC)的分離與以往相同，即取離心后的棕黃色細(xì)胞層。但是接下來的步驟對(duì)于前兩種方法(稱為方法A、方法B)來說便截然不同了。對(duì)于方法A，MNC種植于纖連蛋白包被的組織培養(yǎng)皿，培養(yǎng)48h后，收集非貼壁細(xì)胞重新種植于新的纖連蛋白包被的組織培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)3天，在大約4～7天，早期EPC集落出現(xiàn)，呈現(xiàn)出中間為圓形，周圍包被有紡錘形的細(xì)胞形態(tài)。

對(duì)于方法B，單個(gè)核細(xì)胞被種植于Ⅰ型膠原包被的或纖連蛋白包被的組織培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)過程中，每天棄掉非貼壁細(xì)胞。對(duì)于外周血，在大約2～3周時(shí)(臍帶血及骨髓樣本時(shí)間相對(duì)較短)，晚期EPC集落出現(xiàn)，呈現(xiàn)出鋪路石樣圓形細(xì)胞。

從對(duì)方法A、B的比較中我們可以發(fā)現(xiàn)，其顯然是兩種不同的細(xì)胞群，但是兩種不同的細(xì)胞都具有吞噬乙酰低密度脂蛋白和結(jié)合植物凝集素(如Ulex europaeus agglutinin－1，UEA－1)的能力，并且這一特性被認(rèn)為是EPC的特性之一。但是，我們要想到，纖連蛋白包被的組織培養(yǎng)皿已被用于分離單核細(xì)胞幾十年之久，在A、B方法中，我們?nèi)绾文芘懦渲猩L的單核細(xì)胞對(duì)于EPC的污染呢?因此，單用差速貼壁法來分離培養(yǎng)EPC就顯得仍欠成熟，有著復(fù)雜的不確定因素。但是，其較低的成本花費(fèi)方面的優(yōu)勢依然顯示了其用于臨床的巨大潛力。

第3種方法基于熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)的使用，很大程度上依賴于流式細(xì)胞分選儀(FACS)的使用。首先，某些特殊抗原被選擇為EPC的標(biāo)志，并且使用免疫熒光標(biāo)記的單克隆抗體與上述抗原結(jié)合。根據(jù)其前向散射(forward scatter，F(xiàn)S)、側(cè)向散射(side scatter，SS)及特異性標(biāo)記的熒光，EPC被計(jì)數(shù)或分離出來。在研究者意識(shí)到EPC的亞集之前，僅僅2～3個(gè)抗原的結(jié)合通常被用來分離內(nèi)皮祖細(xì)胞(表1)，但是從表1中我們可以看出，由于EPC與造血干、祖細(xì)胞(HSC/HPC)的相似的抗原表形，要想將EPC與其分離開來單靠上述方法是不夠的，因此，越來越多的爭議接踵而至，并且表現(xiàn)出較以往更加的混亂和難以分析。不過，隨著時(shí)間的推移，關(guān)于EPC的亞集被闡述的更加清晰，抗原的使用也越來越趨于標(biāo)準(zhǔn)化，例如CD34、CD45、CD14、CD133、VEGFR －2 用于 FACS 上的EPC分離純化，而其他的抗原或特性則被用于分離細(xì)胞的鑒定。

其中，對(duì)于早期EPC，其特性有:①4～7天培養(yǎng)后產(chǎn)生;②不典型的融合的單層梭形細(xì)胞;③表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞和造血細(xì)胞標(biāo)志(比如，不僅僅表達(dá) Flt－1、eNOS、vWF、CD31，而且表達(dá) CD45、CD14、CD11b);④結(jié)合UEA－1凝集素且吞噬acLDL;⑤維持造血分化潛能和功能;⑥低增殖能力;⑦體內(nèi)外不產(chǎn)生血管樣管道;⑧體內(nèi)外應(yīng)用可改善新生血管的生成;⑨源于CD45+造血細(xì)胞系;對(duì)于晚期EPC，其特性有:①2～3周培養(yǎng)后產(chǎn)生;②典型的融合的鋪路石樣細(xì)胞;③表達(dá) CD31、CD34、CD105、CD146、VE－Cadherin、eNOS、vWF、VEGFR－2，不表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)志 CD133、CD14、CD11b或者CD45;④結(jié)合UEA－1凝集素且吞噬acLDL;⑤無明顯的造血潛能;⑥高增殖能力;⑦體內(nèi)外能產(chǎn)生血管樣管道;⑧體內(nèi)外應(yīng)用可改善新生血管的生成;⑨源于骨髓(或angioblast)、可能也有血管壁［6］。

盡管至此基于抗原的分離方法的發(fā)展很鼓舞人心，但是有實(shí)驗(yàn)結(jié)果指出，CD34+/AC133+/KDR+細(xì)胞并未得到EPC，因?yàn)樽髡咦C明這僅僅得到了原始的造血祖細(xì)胞并且其無法在體內(nèi)形成血管［12，25］。所以，尋找更加特異的表面標(biāo)志依然存在著進(jìn)一步探索必要性，當(dāng)然，這也同時(shí)指出了我們基于單一分離方式的不足。

除了上述我們涉及到的問題以外，有很大必要性指出，某些細(xì)胞表面標(biāo)志在體外培養(yǎng)或器官發(fā)育的過程中并不是一成不變的，可能隨著成長而不斷改變［6，21］。也就是說，沒有唯一的表形存在，只有對(duì)于細(xì)胞的發(fā)育、分化階段進(jìn)行嚴(yán)格界定，才能保證我們結(jié)果的可重復(fù)性。因此，在這里，我們使用多重標(biāo)準(zhǔn)，步驟為:首先，細(xì)胞的差速貼壁培養(yǎng)法，之后使用FACS進(jìn)行基于表形的分離和鑒定，同時(shí)輔以形態(tài)和功能特征來準(zhǔn)確確定EPC。

三、單獨(dú)移植EPC還是與其他輔助成分共同移植，其效果仍存爭議

許多基于移植沒有精細(xì)分離的骨髓細(xì)胞群的臨床實(shí)驗(yàn)已經(jīng)有所報(bào)道［4］，但是目前對(duì)于注射這種含有大量不必要細(xì)胞群的成分是否可能在長期效果中表現(xiàn)出毒性仍然在研究之中。據(jù)我們所知，骨髓細(xì)胞含有EPC、造血細(xì)胞及其他多種不相關(guān)的多能干細(xì)胞，而這些細(xì)胞能夠分化為多種細(xì)胞，存在于缺血組織的這些多向分化的細(xì)胞及其復(fù)雜的相互作用增加了患者日后潛在并發(fā)癥的可能性，比如心肌細(xì)胞成形術(shù)后晚期發(fā)生的致死性心房纖顫(late－onset lifethreatening arrhythmias)已有報(bào)道［26］。另外，在此領(lǐng)域，許多相矛盾的結(jié)果依然存在，比如對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化損傷，Sata等發(fā)現(xiàn)移植的骨髓細(xì)胞減少了實(shí)驗(yàn)鼠的粥樣斑塊負(fù)荷，盡管其參與了斑塊的構(gòu)成［27］;而Silvestre等卻指出BMC移植后鼠粥樣斑塊明顯增大，但其卻極少參與斑塊的形成［28］。因此，BMC移植的應(yīng)用應(yīng)該在長期的審慎的臨床評(píng)估下進(jìn)行。

隨著科技的發(fā)展，蛋白質(zhì)組學(xué)的概念已深入人心，關(guān)于EPC細(xì)胞培養(yǎng)上清液的質(zhì)譜分析表明，EPC可分泌多種促血管生成的因子，并且可以發(fā)現(xiàn)EPC細(xì)胞中現(xiàn)已證明的眾多重要標(biāo)志，但是，作者對(duì)于EPC的定義并不完善，以及對(duì)于其分泌成分的作用方式也并沒有闡明，所以對(duì)于外周血中EPC這一更具代表性的細(xì)胞的研究顯得尤為迫切，似乎我們可以通過蛋白質(zhì)分泌譜的不同從而根本上區(qū)別目前困擾我們的早期EPC及晚期EPC的區(qū)分問題，并極有可能通過對(duì)比研究找到更具有區(qū)別意義的標(biāo)志性表面標(biāo)志。據(jù)報(bào)道，早期和晚期EPC的聯(lián)合移植較單個(gè)成分的移植表現(xiàn)出了一種相互協(xié)同的作用，增強(qiáng)了其血管生成能力［29］。因此，這些研究表明，針對(duì)EPC治療的有限的有效性，應(yīng)用細(xì)胞或細(xì)胞因子的聯(lián)合移植可能是增強(qiáng)EPC移植效果的一個(gè)很好補(bǔ)充，部分研究人員已經(jīng)開始認(rèn)識(shí)到了區(qū)別對(duì)待兩種EPC的必要性。適時(shí)，我們應(yīng)該放寬視野，將EPC的移植與其他有效的成分的移植結(jié)合起來，更進(jìn)一步拓寬其實(shí)用價(jià)值。

另外，有文章指出，通過轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)一種嵌合蛋白，即基因阱(VEGF trap)，實(shí)驗(yàn)所募集到的骨髓源性的細(xì)胞(RBCC)僅起到一個(gè)旁分泌的效果，而沒有表現(xiàn)出晚期EPC的功能［30］。其中，值得注意的是，雖然缺血或損傷是體內(nèi)新生血管的主要啟動(dòng)因素，但本實(shí)驗(yàn)?zāi)康钠鞴俨]有受到缺血或損傷的影響，而利用了基因阱造成的EPC的募集。那么，我們是否可以推測這只造成了早期EPC的募集而對(duì)晚期EPC沒有影響?據(jù)我們所知，他們均可被內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)所動(dòng)員。更進(jìn)一步說，在Grunewald等的報(bào)告中是否存在兩種EPC亞集的動(dòng)員的一種分離現(xiàn)象呢?如果真是如此，那么晚期EPC的募集似乎就與組織缺血或損傷的程度有關(guān)了。同時(shí)，這一現(xiàn)象用于我們對(duì)早期和晚期EPC的研究可能有重要作用。

總之，面對(duì)冠心病患者中病變較重、遠(yuǎn)端血管完全閉塞、血管纖細(xì)的情況，傳統(tǒng)治療方式所能提供的血運(yùn)重建效果明顯不足。因此，為了縮小心肌梗死發(fā)生后的梗死面積，更加有效的重建缺血心肌的血供，近年來逐漸開展的細(xì)胞移植技術(shù)為我們提供了一個(gè)機(jī)會(huì)。因此，關(guān)于探索更進(jìn)一步改善心肌梗死患者預(yù)后的治療方式已經(jīng)成為目前極為迫切的問題。

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