新型CpG佐劑——BW006協(xié)同乙型肝炎病毒表面抗原活化小鼠B、T淋巴細(xì)胞的作用

何 鵬 張現(xiàn)臣 胡忠玉 方 鑫 邱少輝 梁爭論

近年來的研究表明，細(xì)菌DNA及人工合成的含未甲基化CpG基序的寡核苷酸(CpG－ODN)可刺激機(jī)體免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)天然免疫，促進(jìn)免疫細(xì)胞的增殖和分化，具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用。由于CpG－ODN既能刺激細(xì)胞免疫又能刺激體液免疫，因此被認(rèn)為是一種有潛力的新型免疫佐劑［1，2］。目前國內(nèi)外對于CpG－ODN作為乙型肝炎(乙肝)疫苗佐劑應(yīng)用已有較多研究，而有關(guān)CpG－ODN如何增強(qiáng)免疫機(jī)制的研究仍較為缺乏，影響了對疫苗佐劑免疫原性評價的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定［3～5］。本文對一種新設(shè)計合成的含有CpG基序的寡核苷酸(BW006)對乙肝病毒表面抗原刺激B、T淋巴細(xì)胞免疫的影響進(jìn)行研究。

材料與方法

1.材料:(1)無特定病原體BALB/c小鼠(H－2d):雌性，6～8周，體重16～18g，由中國食品藥品檢定研究院實驗動物中心提供。(2)BW006:序列為5'－tcgacgttcgtcgttcgtcgttc－3'，全硫代修飾，由云南沃森生物技術(shù)有限公司提供。(3)重組乙肝病毒表面抗原:adw2亞型，Hansenular polymorpha yeast表達(dá)，濃度為0.236mg/ml，經(jīng)高效液相(HPLC)和銀染測定純度＞99.0%，細(xì)菌內(nèi)毒素＜10EU/ml(10μg劑量)，由云南沃森生物技術(shù)有限公司提供。(4)培養(yǎng)基:RPMI 1640、胎牛血清均為美國Hyclone公司產(chǎn)品。完全培養(yǎng)基為含10%胎牛血清、20mmol/L HEPES、2mmol/L L－谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸鈉、0.05mmol/L 2－巰基乙醇、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的 RPMI 1640。(5)淋巴細(xì)胞分離液:NycoPrepTM 1.077A，為挪威AXIS－SHIELD PoC AS公司產(chǎn)品。(6)磷酸鹽緩沖液(PBS):8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na2HPO4，0.24g KH2PO4，以超純水溶解并定容至1L(pH 7.2)，過濾除菌，于4℃儲存。(7)牛血清白蛋白(BSA):美國Sigma公司產(chǎn)品。(8)流式抗體:CD80－FITC、CD86－PE、CD69－PE，美國 Bio-Legend公司產(chǎn)品;CD3e－PE－Cy5、CD19－APC，美國BD公司產(chǎn)品。

2.方法:(1)BW006與HBsAg體外刺激對B細(xì)胞活化的影響:①無菌分離小鼠脾單個核細(xì)胞(MNCs)，以完全培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞濃度為2×106/ml;②細(xì)胞孵育:設(shè)4個實驗組，每組4孔，于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入0.5ml MNCs，并分別加入完全培養(yǎng)基(對照組)、40μg HBsAg、5μg BW006、40μg HBsAg+5μg BW006，終體積均為 1ml。置于 37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育24h;③流式熒光抗體標(biāo)記檢測:調(diào)MNCs濃度為1×107/ml，取100μl至流式管，分別用大鼠抗小鼠 APC－CD19、PECD86、FITC－CD80單克隆抗體三色標(biāo)記B細(xì)胞，同時設(shè)陰性對照管、同型對照管，室溫閉光靜置20min。加入2ml PBS，1000r/min離心5min，棄上清，再加入PBS重復(fù)洗滌1次，以500μl 1%多聚甲醛重懸固定細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測，以APC－CD19b圈出B細(xì)胞，計算B細(xì)胞活化分子CD80、CD86表達(dá)水平。(2)BW006與HBsAg體外刺激對T細(xì)胞活化的影響:①脾MNCs分離與孵育，同(1);②熒光抗體標(biāo)記檢測:調(diào)MNCs濃度為1×107/ml。取100μl細(xì)胞至流式管，以大鼠抗小鼠PE－CY5－CD3、PE－CD69單克隆抗體雙色標(biāo)記T細(xì)胞，同時設(shè)陰性對照管、同型對照管，室溫閉光孵育20min。細(xì)胞洗滌與固定同(1)。流式細(xì)胞儀檢測，以PE－CY5－CD3圈出T細(xì)胞，計算T細(xì)胞活化分子CD69表達(dá)水平。(3)BW006與HBsAg體內(nèi)免疫對B細(xì)胞活化的影響:①16只小鼠隨機(jī)分為4組，分別于背部皮下免疫生理鹽水(對照組)、4μg HBsAg、20μg BW006 和 4μg HBsAg+20μg BW006，注射體積均為100微升/只;②免疫24h時處死小鼠，無菌分離脾MNCs;③流式抗體標(biāo)記檢測，同(1)。(4)BW006與HBsAg體內(nèi)免疫對T細(xì)胞活化的影響:①動物免疫方案同(3);②免疫24h時處死小鼠，無菌分離脾MNCs;③流式抗體標(biāo)記檢測，同(2)。

結(jié) 果

1.BW006與HBsAg體外刺激對B細(xì)胞活化的影響:分別以40μg HBsAg、5μg BW006、40μg HBsAg+5μg BW006及完全培養(yǎng)基刺激鼠脾MNCs，24h時檢測B細(xì)胞CD80和CD86的表達(dá)水平。結(jié)果如圖1所示，體外刺激24h時，5μg BW006組和40μg HBsAg+5μg BW006組 B細(xì)胞 CD80陽性率(25.88% ±1.92%，27.36% ±1.77%)顯著高于對照組(10.41% ± 0.72%)(P 均 ＜0.01)，CD86 陽性率(98.90% ±0.16%，98.92% ±0.09%)顯著高于對照組(74.85% ±5.13%)(P 均 ＜0.01)，CD86 平均熒光強(qiáng)度(832.66 ±51.08，877.64 ±53.72)顯著高于對照組(377.01 ±24.61)(P 均 ＜0.01)。

圖1 BW006與HBsAg體外刺激B細(xì)胞活化分子CD80、CD86的表達(dá)

2.BW006與HBsAg體外刺激對T細(xì)胞活化的影響:分別以 40μg HBsAg、5μg BW006、40μg HBsAg+5μg BW006及完全培養(yǎng)基刺激鼠脾MNCs，24h時檢測T細(xì)胞表面分子CD69的表達(dá)水平，結(jié)果見圖2。40μg HBsAg+5μg BW006組CD69表達(dá)陽性率顯著高于對照組(12.47% ±3.31%vs 7.15% ±1.37%，P＜0.01);40μg HBsAg+5μg BW006 組 CD69平均熒光強(qiáng)度顯著高于 BW006組(387.11±10.32 vs 307.85 ±11.46，P ＜0.01)和對照組(387.11 ±10.32 vs 130.06 ±13.32，P ＜0.01)。

圖2 BW006與HBsAg體外刺激T細(xì)胞活化分子CD69的表達(dá)

3.BW006與HBsAg體內(nèi)免疫對B細(xì)胞活化的影響:如圖 3 所示，免疫 24h時，4μg HBsAg+20μg BW006組小鼠脾B細(xì)胞CD80的陽性率顯著高于BW006 免疫組(12.26% ±2.33%vs 9.80% ±1.17%，P＜0.05)和生理鹽水免疫組(12.26% ±2.33%vs 8.50% ±1.34%，P ＜0.05)，CD86陽性率顯著高于生理鹽水免疫組(63.84% ±1.48%vs 56.69% ±1.33%，P＜0.05)，CD86平均熒光強(qiáng)度顯著高于BW006免疫組(94.71% ±6.51%vs 91.22% ±4.36%，P ＜0.05)和生理鹽水免疫組(94.71% ±6.51%vs 85.46% ±1.01%，P ＜0.05)。

圖3 BW006與HBsAg皮下免疫誘導(dǎo)B細(xì)胞CD80、CD86分子的表達(dá)

4.BW006與HBsAg體內(nèi)免疫對T細(xì)胞活化的影響:皮下免疫 20μg BW006和(或)4μg HBsAg，24h時檢測T表面協(xié)同刺激分子CD69的表達(dá)水平，結(jié)果如圖4所示。BW006聯(lián)合HbsAg免疫24h時T細(xì)胞CD69表達(dá)陽性率顯著高于BW006組(33.97% ±2.17% vs 31.32% ±2.78%，P＜0.05)和生理鹽水組(33.97% ±2.17%vs 27.77%±2.51%，P＜0.05)，CD69平均熒光強(qiáng)度顯著高于生理鹽水組(182.14% ±11.29%vs 162.92% ±6.44%，P ＜ 0.05)。

圖4 BW006與HbsAg皮下免疫誘導(dǎo)NK細(xì)胞早期活化分子CD69的表達(dá)

討 論

CpG－ODN是以未甲基化的CpG為核心的寡聚脫氧核苷酸，具有廣泛的生物學(xué)活性，如非特異性抗感染、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等［6～8］。但目前有關(guān)CpGODN細(xì)胞免疫機(jī)制的研究主要集中在體液免疫方面，對其細(xì)胞免疫的研究較少。為研究BW006對免疫細(xì)胞的活化作用，我們通過體外克隆刺激與體內(nèi)免疫刺激的途徑，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)探討了一種新型CpG－ODN(BW006)對B、T淋巴細(xì)胞膜表面分子表達(dá)的影響，對BW006在B、T淋巴細(xì)胞免疫機(jī)制中的作用進(jìn)行了研究，為其作為乙肝疫苗佐劑提供依據(jù)。

CD80、CD86是兩個提供協(xié)同刺激信號的重要分子，二者均以單體形式表達(dá)于抗原遞呈細(xì)胞表面。經(jīng)活化后，CD80、CD86的表達(dá)均顯著上調(diào)。激活的B細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞均表達(dá)高水平CD80 和 CD86［9］。

CD69是C－型凝集素受體家族的成員，通常以同源二聚體形式存在，靜止的T細(xì)胞一般不表達(dá)CD69，通過T細(xì)胞受體接受刺激后表達(dá)CD69，后者作為細(xì)胞共刺激信號進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞的活化或增殖分化［10，11］。

BW006和HBsAg體外誘導(dǎo)小鼠免疫細(xì)胞活化結(jié)果表明，BW006和HBsAg聯(lián)合誘導(dǎo)B細(xì)胞活化水平顯著高于對照組，但與單用BW006誘導(dǎo)B細(xì)胞活化水平比較無顯著性差異，可能與BW006本身活化B細(xì)胞作用較強(qiáng)有關(guān);而BW006和HBsAg聯(lián)合誘導(dǎo)T細(xì)胞活化水平顯著高于對照組，且熒光強(qiáng)度亦顯著高于BW006組，表明BW006體外刺激可協(xié)同HBsAg活化T淋巴細(xì)胞。B細(xì)胞與T細(xì)胞活化情況略有不同，可能與BW006和HBsAg對不同免疫細(xì)胞刺激機(jī)制不同有關(guān)。

BW006和HBsAg聯(lián)合免疫小鼠，可顯著上調(diào)B細(xì)胞表面分子CD80、CD86和T細(xì)胞早期活化分子CD69的表達(dá)水平。由此可見，BW006能夠協(xié)同HB-sAg活化T細(xì)胞。表明BW006體內(nèi)刺激可協(xié)同HB-sAg活化B、T淋巴細(xì)胞。

本研究結(jié)果表明，BW006聯(lián)合HBsAg，能夠有效活化B、T淋巴細(xì)胞，提高機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答水平。活化劑作為新型預(yù)防性或治療性乙肝疫苗的新型佐劑具有較大的潛力。

1 Lin KW，Kirchner JT.Hepatitis B［J］.Am Fam Physician，2004，69(1):75－82

2 Mostert MC，Richardus JH，De M R.Referral of chronic hepatitis B patients from primary to specialist care:making a simple guideline work［J］.J Hepatol，2004，41(6):1026 －1030

3 孫玉紅，朱朝敏，謝堯.含CpG基序的寡脫氧核苷酸聯(lián)合乙型肝炎表面抗原免疫轉(zhuǎn)基因小鼠的實驗研究［J］.中華肝臟病雜志，2005，13(1):61 －62

4 Malanchere－Bres E，Payette PJ，Mancini M，et al.CpG oligodeoxynucleotides with hepatitis B surface antigen(HBsAg)for vaccination in HBsAg－transgenic mice［J］.J Virol，2001，75:6482 －6491

5 李文波，張修禮，姚志強(qiáng).含CpG基序的寡核苷酸對乙型肝炎病毒基因疫苗的細(xì)胞免疫效應(yīng)的影響［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2004，14(10):104 －107

6 Krieg A M.Antiinfective applications of toll－like receptor 9 agonists［J］.Proc Am Thorac Soc，2007，4(3):289 －294

7 Friedberg J W，Kim H，Mccauley M，et al.Combination immunotherapy with a CpG oligonucleotide(1018 ISS)and rituximab in patients with non－h(huán)odgkin lymphoma:increased interferon－alpha/beta－inducible gene expression，without significant toxicity［J］.Blood，2005，105(2):489－495

8 Weigel B J，Rodeberg D A，Krieg A M，et al.CpG oligodeoxynucleotides potentiate the antitumor effects of chemotherapy or tumor resection in an orthotopic murine model of rhabdomyosarcoma［J］.Clin Cancer Res，2003，9(8):3105－3114

9 Kalinski P，Hilkens C M，Wierenga E A，et al.T－cell priming by type－1 and type－2 polarized dendritic cells:the concept of a third signal［J］.Immunol Today，1999，20(12):561 －567

10 Cho D，Campana D.Expansion and activation of natural killer cells for cancer immunotherapy［J］.Korean J Lab Med，2009，29(2):89 －96

11 Vazquez BN，Laguna T，Carabana J，et al.CD69 gene is differentially regulated in T and B cells by evolutionarily conserved promoter－distal elements［J］.J Immunol，2009，183(10):6513－6521