反膠束體系中固定化胃蛋白酶的催化性質(zhì)研究

伏振宇，李志光，何純蓮

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學理學院，湖南 長沙 410128；2.湖南師范大學醫(yī)學院，湖南 長沙 410006)

反膠束酶反應(yīng)系統(tǒng)是膠體界面化學與生物技術(shù)交叉領(lǐng)域的研究內(nèi)容[1]。在非水有機介質(zhì)中，對反膠束體系酶催化性能的研究已受到廣泛關(guān)注[2～6]。反膠束體系包括3個組成部分：表面活性劑、水和非極性有機溶劑。表面活性劑的極性頭部指向含水微球的內(nèi)部，脂肪族的尾部指向非極性有機溶劑。在反膠束體系中水結(jié)構(gòu)的形成可能與生物膜類似[7]，有資料指出，當酶處在細胞內(nèi)的環(huán)境中時，反膠束體系能夠與周圍的微環(huán)境相適應(yīng)[2，8]。

反膠束介質(zhì)在宏觀上為均一透明的熱力學穩(wěn)定體系，在微觀上則可視為由高度分散的單個反膠束聚集體構(gòu)成的非均一溶液，可為反應(yīng)提供受納米尺度調(diào)控的介觀環(huán)境，因而被視為納米反應(yīng)器的一種類型[1]。近年來，隨著納米科學技術(shù)的迅速發(fā)展，反膠束作為納米反應(yīng)器的優(yōu)點也不斷凸現(xiàn)[9，10]，被視為很容易改變酶的物理性質(zhì)的微型反應(yīng)器。人們通過改變這種環(huán)境的物理性質(zhì)，有可能在發(fā)生反應(yīng)的“水池”里定制各種性質(zhì)的模型。

胃蛋白酶在監(jiān)測分析和食品工業(yè)中具有重要價值。作者在此用CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)/環(huán)己烷/正辛醇反膠束體系固定胃蛋白酶，討論了反膠束體系含水率、乙醇體積分數(shù)對固定化胃蛋白酶活力的影響，并對固定化胃蛋白酶與游離胃蛋白酶的催化性質(zhì)進行了比較，擬為反膠束中胃蛋白酶用于酶法測定提供參考。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

胃蛋白酶，上海泛柯生物科技有限公司；酪蛋白，杭州微生物試劑有限公司；L-酪氨酸，西安沃爾森生物技術(shù)有限公司；CTAB，湖南湘中化學試劑有限公司；其它試劑均為分析純。

WFZ800-D3B型紫外可見分光光度計，北京瑞利分析儀器公司；空氣搖床，上海智城分析儀器制造有限公司；TDL-4ZB型臺式低速自動平衡離心機，湖南星科科學儀器有限公司；ZSD-2型卡爾費休水分測定儀，上海易友儀器有限公司；JY88-IIN型超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 胃蛋白酶溶液的制備

準確稱量25 mg胃蛋白酶，用pH=3的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液溶解并定容至50 mL，即得0.5 mg·mL-1的胃蛋白酶溶液。

1.2.2 固定化胃蛋白酶的制備

CTAB反膠束體系的制備：稱量9.0 g CTAB，加入30 mL環(huán)己烷和120 mL正辛醇，置于超聲波細胞粉碎機中溶解至無色透明，冷卻后于4 ℃冰箱中保存。

取10 μL 0.5 mg·mL-1的胃蛋白酶溶液和80 μL pH=3的緩沖溶液加至2.0 mL CTAB反膠束體系中，用力振蕩，置于恒溫搖床中180 r·min-1振蕩20 min至無色透明，即制得胃蛋白酶反膠束。取90 μL 8.0 mg·mL-1的酪蛋白，加至2.0 mL CTAB反膠束體系中，用力振蕩，置于恒溫搖床中180 r·min-1振蕩20 min至無色透明，即制得酪蛋白反膠束。

改變注入反膠束體系中緩沖溶液的體積，可以獲得不同含水率的胃蛋白酶反膠束和酪蛋白反膠束。為測定助溶劑乙醇對固定化胃蛋白酶的影響，制備了不同乙醇體積分數(shù)的胃蛋白酶反膠束和酪蛋白反膠束。

1.2.3 固定化胃蛋白酶催化性質(zhì)研究

為了避免胃蛋白酶與表面活性劑或有機溶劑接觸可能導致的酶變性，將胃蛋白酶反膠束和酪蛋白反膠束進行混合，引發(fā)固定化酶的催化反應(yīng)，以研究反膠束體系中固定化胃蛋白酶的催化性質(zhì)。

1.3 分析測試

1.3.1 酶活力的測定[11]

酶活力定義：在一定條件下，每分鐘催化水解酪蛋白生成1 μmol酪氨酸的酶量為一個蛋白酶活力單位。

在25 °C，用紫外可見分光光度計檢測275 nm水解酪蛋白的吸光度增加量。

1.3.2 酶動力學參數(shù)的測定

酶動力學參數(shù)可由米氏方程測定：

式中：v為酶促反應(yīng)速率；vmax為酶被底物飽和時的反應(yīng)速度；c為底物濃度；Km為米氏常數(shù)，表示v=(1/2)vmax時的底物濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 含水率對固定化胃蛋白酶活力的影響

25 ℃下，改變注入反膠束體系中緩沖溶液的體積，獲得含水率為7%～18%的胃蛋白酶反膠束和酪蛋白反膠束，混合，引發(fā)酶促反應(yīng)，然后用紫外可見分光光度計檢測275 nm水解酪蛋白的吸光度增加量，考察含水率對固定化胃蛋白酶活力的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 含水率對固定化胃蛋白酶活力的影響

由圖1可知，反膠束含水率為12%時固定化胃蛋白酶有最大的催化效率。當含水率低于12%時，酶活力隨著含水率的增加而上升；當含水率高于12%時，酶活力隨著含水率的增加呈現(xiàn)下降的趨勢。這是因為，在反膠束內(nèi)，可能存在不同水結(jié)構(gòu)的區(qū)域[12]，一個區(qū)域的周圍有表面活性劑的極性頭部，而另一個區(qū)域則是“水池”中間的自由水。在低含水率下，所有的水被結(jié)構(gòu)化，酶的穩(wěn)定性較高；當含水率增加時，反膠束的水結(jié)構(gòu)會改變，固定化酶的活力相應(yīng)升高，直至達到最高；當含水率繼續(xù)增加時，自由水的含量會增加，固定化酶的活力和穩(wěn)定性均會降低；在更高的含水率下，由于反膠束體系的不穩(wěn)定性導致固定化酶活力急劇下降。

2.2 乙醇體積分數(shù)對固定化胃蛋白酶活力的影響

25 ℃下，將乙醇體積分數(shù)為0%、10%、20%、30%、40%、50%的胃蛋白酶反膠束和乙醇體積分數(shù)為0%、10%、20%、30%、40%、50%的酪蛋白反膠束混合，引發(fā)酶促反應(yīng)，然后用紫外可見分光光度計檢測275 nm水解酪蛋白的吸光度增加量，考察乙醇體積分數(shù)對固定化胃蛋白酶活力的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 乙醇體積分數(shù)對固定化胃蛋白酶活力的影響

由圖2可知，反膠束的乙醇體積分數(shù)為30%時固定化胃蛋白酶有最大的催化效率。當乙醇體積分數(shù)低于30%時，酶活力隨著乙醇體積分數(shù)的增加而上升；當乙醇體積分數(shù)高于30%時，酶活力隨著乙醇體積分數(shù)的增加呈現(xiàn)下降的趨勢。這是因為，在較低乙醇體積分數(shù)下，乙醇的助溶作用使胃蛋白酶進入到“水池”中，從而避免了有機溶劑和表面活性劑對其活性位點的抑制作用[13]，胃蛋白酶活力隨乙醇體積分數(shù)的增加而上升；而在較高乙醇體積分數(shù)下，由于反膠束體系的不穩(wěn)定性導致固定化胃蛋白酶活力下降。

2.3 游離酶和固定化酶的最適溫度

不同溫度下游離胃蛋白酶和固定化胃蛋白酶的相對酶活力見圖3。

圖3 溫度對胃蛋白酶活力的影響

由圖3可知，游離胃蛋白酶的最適溫度為40 ℃，酶活力隨溫度的升高變化幅度較??；固定化胃蛋白酶的最適溫度為50 ℃，酶活力隨溫度的升高變化幅度較大。這表明固定化胃蛋白酶對溫度變化較明顯、敏感。經(jīng)固定化后，由于反膠束外層的非極性尾部對“水池”中的胃蛋白酶有保護作用，使胃蛋白酶的熱穩(wěn)定性增強，最適溫度升高了10 ℃。

2.4 游離酶和固定化酶的最適Ca2+濃度

向緩沖溶液中加入不同濃度的Ca2+，配制成不同濃度的含胃蛋白酶的Ca2+溶液，進行酶促反應(yīng)，測定酶活力，結(jié)果見圖4。

圖4 Ca2+濃度對胃蛋白酶活力的影響

由圖4可知，游離胃蛋白酶和固定化胃蛋白酶的最適Ca2+濃度分別為0.01 mol·L-1和0.02 mol·L-1。加入一定濃度的Ca2+能使游離胃蛋白酶活力上升，原因可能是在Ca2+存在下，酪蛋白的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得疏松，增加了胃蛋白酶作用的接觸位點，酶活力相應(yīng)升高；但當Ca2+濃度超過0.01 mol·L-1時，酶活力反而呈現(xiàn)下降的趨勢。而固定化胃蛋白酶活力只在一個較窄Ca2+濃度范圍顯著上升，當Ca2+濃度超過0.02 mol·L-1時酶活力反而降低。原因可能是CTAB是陽離子表面活性劑，當加入過量的Ca2+時，反膠束內(nèi)酶所處的微水環(huán)境的離子強度過高，會抑制胃蛋白酶的活性[6]。

2.5 游離酶和固定化酶的動力學參數(shù)

分別配制不同濃度的酪蛋白溶液和酪蛋白反膠束，進行酶促反應(yīng)，測定游離胃蛋白酶和固定化胃蛋白酶的動力學參數(shù)，采用雙倒數(shù)法作圖，結(jié)果見圖5。

圖5 胃蛋白酶的Lineweaver-Burk曲線

在25 ℃、pH值為3的條件下，游離胃蛋白酶的動力學參數(shù)為Km=1.29×10-4mol·L-1、vmax=4.00×10-5μmol·L-1·min-1；固定化胃蛋白酶的動力學參數(shù)為Km=1.22×10-4mol·L-1、vmax=2.64×10-6μmol·L-1·min-1。固定化胃蛋白酶的米氏常數(shù)Km比游離胃蛋白酶的小，說明反膠束體系中固定化胃蛋白酶與底物的親和力有所增大。

2.6 游離酶和固定化酶的儲存穩(wěn)定性

25 ℃下，游離胃蛋白酶和固定化胃蛋白酶的儲存穩(wěn)定性見圖6。

圖6 胃蛋白酶的儲存穩(wěn)定性

由圖6可知，固定化胃蛋白酶的儲存穩(wěn)定性比游離胃蛋白酶的要好。25 ℃放置5 d后，固定化胃蛋白酶保留37%的酶活力，而游離胃蛋白酶僅保留8%的酶活力。這是由于反膠束能提供酶的天然環(huán)境[6]，能夠更好地保持酶的活性。

3 結(jié)論

研究表明，利用CTAB/環(huán)己烷/正辛醇反膠束體系制備的固定化胃蛋白酶在反膠束含水率為12%、乙醇體積分數(shù)為30%時活力達到最佳。固定化胃蛋白酶和游離胃蛋白酶的最適溫度分別為50 ℃和40 ℃、最適Ca2+濃度分別為0.02 mol·L-1和0.01 mol·L-1，對酪蛋白的米氏常數(shù)Km分別為1.22×10-4mol·L-1和1.29×10-4mol·L-1。固定化胃蛋白酶較游離胃蛋白酶具有更高的酶活力、更好的熱穩(wěn)定性和儲存穩(wěn)定性。

[1]梁運姍，袁興中，曾光明，等.表面活性劑在逆膠束酶反應(yīng)系統(tǒng)中的作用機制[J].中國科學：化學，2011，41(5)：763-772.

[2]Luisi P L，Giomini M，Pileni M P，et al.Reverse micelles as hosts for proteins and small molecules[J].Biochim Biophys Acta，1988，947(1)：209-246.

[3]Dordick J S，Khmelnitsky Y L，Sergeeva M V.The evolution of biotransformation technologies[J].Curr Opin Microbiol，1998，1(3)：311-318.

[4]Tuena de Gómez-Puyou M，Gómez-Puyou A.Enzymes in low water systems[J].Crit Rev Biochem Mol，1998，33(1)：53-89.

[5]Carvalho C M L，Cabral J M S.Reverse micelles as reaction media for lipases[J].Biochimie，2000，82(11)：1063-1085.

[6]Tonova K，Lazarova Z.Reversed micelle solvents as tools of enzyme purification and enzyme-catalyzed conversion[J].Biotechnology Advances，2008，26(6)：516-532.

[7]Boicelli C A，Conti F，Giomini M，et al.The influence of phosphate buffers on the31P longitudinal relaxation time in inverted micelles[J].Spectrochim Acta Part A：Mol Spectrosc，1982，38(2)：299-300.

[8]Nicot C，Vacher M，Vincent M，et al.Membrane proteins in reverse micelles：Myelin basic protein in a membrane-mimetic environment[J].Biochemistry，1985，24(24)：7024-7032.

[9]馮緒勝，劉洪國，郝京誠.膠體化學[M].北京：化學工業(yè)出版社，2005：183-202.

[10]鐘克利，尹炳柱，金龍一.膠束作為納米反應(yīng)器的研究進展[J].高分子通報，2009，(2)：48-57.

[11]中國藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京：科學出版社，2000：466-467.

[12]Bru R，Sánchez-Ferrer A，García-Carmona F.Kinetics models in reverse micelles[J].Biochem J，1995，310：721-739.

[13]Marhuenda-Egea Frutos C，Piera-Velázquez S, Cadenas C，et al.Reverse micelles in organic solvents：A medium for the biotechnological use of extreme halophilic enzymes at low salt concentration[J].Archaea，2002，1(2)：105-111.