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    聚合物納米微球分離純化格爾德霉素方法研究

    2011-07-26 01:44:20張雪霞李曉露王海燕
    化學(xué)與生物工程 2011年7期
    關(guān)鍵詞:爾德層析微球

    李 寧,張雪霞,李曉露,王海燕,林 毅,蔣 沁

    (微生物藥物國家工程研究中心,河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心,華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司,河北 石家莊 050015)

    格爾德霉素(Geldanamycin)屬于苯醌安莎霉素類,它的結(jié)構(gòu)特征是一個(gè)苯醌部分與一個(gè)平面性大環(huán)安莎橋相連[1]。具有抗原蟲、抗細(xì)菌、抗真菌、抗腫瘤、抗病毒以及免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性。格爾德霉素通過特異性結(jié)合并抑制熱休克蛋白90(Hsp90),起到抑制腫瘤細(xì)胞和抗病毒的作用[2,3]?;瘜W(xué)家們合成得到了一些具有較高抗腫瘤活性的格爾德霉素衍生物,已進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn),有望成為新的抗腫瘤藥物[4]。

    目前已知的格爾德霉素純化方法[5],多采用反復(fù)提取、樹脂吸附、萃取、層析、結(jié)晶等過程,步驟繁瑣,收率低。作者采用聚合物納米微球?qū)Ω駹柕旅顾匕l(fā)酵菌絲體的浸提濃縮物直接進(jìn)行層析純化,得到高純度格爾德霉素,簡化了工藝過程,提高了成品收率,質(zhì)量可控,適于工業(yè)化生產(chǎn)。

    1 實(shí)驗(yàn)

    1.1 試藥、試劑與儀器

    格爾德霉素發(fā)酵液,華北制藥新藥公司。

    格爾德霉素對(duì)照品,Sigma公司;聚合物納米微球,蘇州納微科技公司;乙腈,色譜純,Merck公司;雙蒸餾水,自制;乙醇,國產(chǎn)分析純。

    中壓層析系統(tǒng)(C-601泵,C-615控制器,C-616收集器,C-635檢測器),瑞士Büchi公司;高效液相色譜儀(515泵,2996檢測器),美國Waters公司。

    1.2 發(fā)酵液預(yù)處理

    格爾德霉素存在于菌絲體內(nèi)。在發(fā)酵液中加入3%(質(zhì)量體積比,g∶mL)的珍珠巖,攪拌30 min后過濾,水洗,得格爾德霉素菌絲體。向其中加入3倍(體積質(zhì)量比,mL∶g,下同)95%乙醇,攪拌浸提1 h,過濾,得浸提液;向浸提后的菌絲體中再加入1倍95%乙醇,攪拌浸提1 h,過濾,得二次浸提液;合并浸提液,40 ℃減壓濃縮至基本無乙醇流出,過濾,得深黃色固體,為格爾德霉素浸提濃縮物。

    1.3 聚合物納米微球?qū)游鰲l件的選擇

    裝柱:取100 g聚合物納米微球用0.1 mol·L-1的NaOH溶液浸泡2 h,水洗至中性,重力沉降法裝柱(2.5 cm×30 cm),用40%乙醇平衡系統(tǒng)。

    1.3.1 聚合物納米微球型號(hào)的篩選

    分別用型號(hào)為PS30RPC、NM-MM100、PS/PVB300的聚合物納米微球裝柱,取0.8 g格爾德霉素浸提濃縮物用95%乙醇溶解后加樣于層析柱,用120 mL 40%乙醇洗滌,然后用不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫,洗脫速度5 mL·min-1,收集洗脫液,每管10 mL。HPLC檢測分離效果,將格爾德霉素含量(面積歸一法,下同)大于98.5%的接收液合并,計(jì)算洗脫收率。

    1.3.2 洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇

    取0.8 g格爾德霉素浸提濃縮物用95%乙醇溶解后加樣于PS30RPC聚合物納米微球柱上,用40%乙醇洗滌層析柱,然后用不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫,洗脫速度5 mL·min-1,通過中壓層析色譜檢測器在線監(jiān)測,觀察格爾德霉素主峰與雜質(zhì)峰的分離效果。

    1.3.3 洗脫速度的選擇

    取0.8 g格爾德霉素浸提濃縮物用95%乙醇溶解后加樣于PS30RPC聚合物納米微球柱上,用120 mL 40%乙醇洗滌,用65%乙醇作為洗脫劑,分別采用4 mL·min-1、5 mL·min-1、6 mL·min-1、7 mL·min-1、8 mL·min-1的洗脫速度進(jìn)行洗脫,收集洗脫液,每管10 mL。HPLC檢測分離效果,將格爾德霉素含量大于98.5%的接收液合并,計(jì)算洗脫收率。

    1.3.4 加樣量的選擇

    分別按照加樣量(格爾德霉素浸提濃縮物與聚合物納米微球質(zhì)量比,g∶g,下同)為1∶150、1∶125、1∶100、1∶75、1∶50加樣,用120 mL 40%乙醇洗滌層析柱,用65%乙醇洗脫,洗脫速度6 mL·min-1,收集洗脫液,每管10 mL。HPLC檢測分離效果,將格爾德霉素含量大于98.5%的接收液合并,計(jì)算洗脫收率。

    1.4 結(jié)晶

    合并格爾德霉素含量大于98.5%的洗脫液,減壓濃縮至基本無乙醇,5 ℃放置2 h,過濾,用水洗滌濾餅,真空干燥,得到格爾德霉素粉末。

    1.5 HPLC色譜條件

    色譜柱:Hypersil C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);柱溫為室溫;流動(dòng)相為乙腈-水(70︰30);流速1.0 mL·min-1;檢測波長304 nm;進(jìn)樣量10 μL。

    稱取格爾德霉素對(duì)照品10 mg用流動(dòng)相溶解,配制成約25 μg· mL-1的溶液。取對(duì)照品溶液10 μL注入色譜儀,按上述色譜條件外標(biāo)法測定,以峰面積計(jì)算。該方法在格爾德霉素濃度為0.75~75 μg· mL-1時(shí)有良好線性關(guān)系(R=0.9999);平均回收率(n=5) 為100.2%,RSD為0.37%。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 聚合物納米微球?qū)游鰲l件的確定

    2.1.1 聚合物納米微球型號(hào)的確定(圖1)

    圖1 不同型號(hào)聚合物納米微球的洗脫收率

    從圖1可知,PS30RPC聚合物納米微球在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、70%時(shí)對(duì)格爾德霉素的分離效果均較好,因此,選擇PS30RPC聚合物納米微球作為層析填料。

    2.1.2 洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)的確定

    通過中壓層析色譜檢測器在線監(jiān)測發(fā)現(xiàn),乙醇體積分?jǐn)?shù)大于65%時(shí),格爾德霉素洗脫過快,主峰與雜質(zhì)峰不能有效分離;當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)小于65%時(shí),色譜峰拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重,且格爾德霉素洗脫速度大于雜質(zhì)擴(kuò)散速度,分離效果并沒有提高。乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%時(shí),格爾德霉素分離效果好、洗脫速度快。因此,選擇洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%。

    2.1.3 洗脫速度的確定(圖2)

    圖2 不同洗脫速度下的洗脫收率

    從圖2可知,洗脫速度為6.0 mL·min-1時(shí),洗脫收率最高,因此,選擇洗脫速度為6.0 mL·min-1。

    2.1.4 加樣量的確定(圖3)

    圖3 不同加樣量下的洗脫收率

    從圖3可知,在保證分離度的前提下,隨著格爾德霉素加樣量的增加,格爾德霉素的洗脫收率逐漸下降,當(dāng)加樣量超過1∶100時(shí),洗脫收率顯著下降,低于80%。片面地增加加樣量,會(huì)導(dǎo)致上樣過載,造成格爾德霉素與雜質(zhì)的重疊,使格爾德霉素的洗脫收率降低。綜合單批產(chǎn)量與產(chǎn)品回收率,選擇加樣量為1∶100。

    2.2 工藝驗(yàn)證

    確定聚合物納米微球分離純化格爾德霉素的工藝為:采用PS30RPC型聚合物納米微球作為層析填料,格爾德霉素浸提濃縮物用95%乙醇溶解后加樣于層析柱,用120 mL 40%乙醇洗滌后,65%乙醇洗脫,洗脫速度6.0 mL·min-1,加樣量(樣品∶填料,g∶g)為1∶100。經(jīng)過5批中試放大,結(jié)果表明:PS30RPC型聚合物納米微球可以很好地對(duì)格爾德霉素發(fā)酵菌絲體浸提物進(jìn)行純化,平均層析收率為92.5%,總平均收率為81.6%,平均成品純度為98.7%。

    3 結(jié)論

    確定聚合物納米微球分離純化格爾德霉素工藝為:選擇PS30RPC型聚合物納米微球?yàn)閷游鎏盍?,將格爾德霉素發(fā)酵菌絲體浸提物用95%乙醇溶解后加樣于層析柱,用120 mL 40%乙醇洗滌,65%乙醇洗脫,洗脫速度6.0 mL·min-1,加樣量(樣品∶填料,g∶g)1∶100。此時(shí),平均層析收率為92.5%、平均總收率為81.6%、平均成品純度為98.7%。該分離純化方法簡便可靠,適于工業(yè)化生產(chǎn)。

    [1] 廖志勇,甄永蘇.熱休克蛋白90抑制劑Geldanamycin的抗腫瘤作用研究進(jìn)展[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2001,36(9):716-720.

    [2] Blagosklonny M V.Hsp-90-associated oncoproteins:Multiple targets of geldanamycin and its analogs[J].Leukemia,2002,16(4):455-462.

    [3] Chiosis G.Targeting chaperones in transformed systems—A focus on Hsp90 and cancer[J].Expert Opinion on Therapeutic Targets,2006,10(1):37-50.

    [4] Nowakowski G S,McCollum A K,Ames M M,et al.A phase I trial of 17-allylamino-17-demethoxy-geldanamycin in patients with advanced cancer[J].Clinical Cancer Research,2006,12(20):6087-6093.

    [5] 劉濤,屈凌波,李繼安,等.格爾德霉素分離純化工藝的研究[J].藥物生物技術(shù),2010,17(3):247-250.

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