拮抗油菜菌核病的海洋細(xì)菌篩選及其活性物質(zhì)的分子檢測

林建朋，邵宗澤，陳 莉，孫風(fēng)芹，張智濤，喻子牛，張吉斌

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室 微生物農(nóng)藥國家工程研究中心，湖北 武漢 430070；2.國家海洋局第三海洋研究所 海洋生物遺傳資源重點實驗室，福建 廈門 361005)

目前農(nóng)業(yè)上對植物病原菌害的生物防治已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但是對于很多的病原菌如油菜菌核、棉花枯萎、小麥紋枯等尚無非常有效的生物防治方法，因此對新型微生物資源和活性物質(zhì)的尋找迫在眉睫。隨著陸地生物源天然產(chǎn)物資源的逐漸減少，從陸地上發(fā)現(xiàn)對這些病原菌有抗菌活性的新型天然產(chǎn)物更加困難，因此科學(xué)家們將目光投向了占地球表面積達(dá)70%以上的海洋環(huán)境，尤其是海洋微生物，期待能從中發(fā)現(xiàn)具有新型結(jié)構(gòu)的抗菌化合物[1]。海洋環(huán)境與陸地差異很大，高鹽、高壓、低營養(yǎng)、低溫、低光照等極端環(huán)境賦予了其微生物種類的多樣性和代謝方式的特異性[2，3]。

海洋微生物活性物質(zhì)的相關(guān)研究從20 世紀(jì)60 年代逐步開始，近幾年從海洋微生物中篩選的新型病原微生物拮抗菌及其代謝產(chǎn)物的研究逐年增多，2002 年發(fā)表的新型結(jié)構(gòu)的677種海洋活性物質(zhì)中有約1/5來自海洋微生物[4]。研究人員已從海洋細(xì)菌、放線菌和真菌中分離出眾多抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗寄生蟲的微生物及具有新分子結(jié)構(gòu)的先導(dǎo)化合物[5，6]，其中有些已經(jīng)進(jìn)入了臨床研究階段，而從海洋微生物中篩選抗重要作物病原菌的拮抗菌的研究仍較少。因此，作者從海洋細(xì)菌中篩選對重要作物病原菌有拮抗作用的拮抗菌，對于解決困擾人們的多種重要作物病害問題具有十分重要的意義。

1 實驗

1.1 菌種與指示病原菌

海洋細(xì)菌共計1021株，由國家海洋局第三海洋研究所海洋生物遺傳資源重點實驗室和中國海洋微生物菌種保藏管理中心(MCCC)提供。

陽性對照菌株P(guān).fluorescensCHA0、P.fluorescensPf-5、P.fluorescens2-79和P.fluorescensQ8r1-96由美國華盛頓州立大學(xué)植物病理系David Weller教授提供。

油菜菌核病病原真菌核盤菌[Sclerotiniasclerotiorum(Lib.) de Bary]，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室菌種保藏中心(MGSC)提供。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 海洋細(xì)菌培養(yǎng)基

海水培養(yǎng)基(MB)：蛋白胨5 g，酵母粉1 g，天然海水(3.4%鹽)1000 mL。

2216E培養(yǎng)基：配方詳見文獻(xiàn)[7]。

MLB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1000 mL。

MHLB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母粉 5 g，NaCl 30 g，蒸餾水1000 mL。

M2培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，酵母粉1 g，醋酸鈉5 g，天然海水1000 mL，pH值7.5～7.6。

PTA培養(yǎng)基：蛋白胨0.5 g，酵母膏0.5 g，葡萄糖0.2 g，蔗糖0.2 g，硝酸銨2 g，無水乙酸鈉2 g，馬鈴薯浸出粉0.5 g，天然海水1000 mL，pH值7.4～7.5。

2 L培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母粉2 g，硝酸銨0.2 g，無水乙酸鈉1 g，檸檬酸三鈉0.5 g，普通肉汁培養(yǎng)基(粉)0.5 g，天然海水1000 mL，pH值7.5～7.6。

1.2.2 植物病原菌培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：新鮮去皮土豆200 g，蔗糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL。

1.3 方法

1.3.1 植物病原真菌核盤菌的活化與培養(yǎng)

從4 ℃保藏的試管斜面上取出小塊核盤菌菌絲塊，接于PDA培養(yǎng)基平板中央，置于25 ℃培養(yǎng)1～2 d，連續(xù)活化2～3次，待用。

1.3.2 海洋細(xì)菌的活化與培養(yǎng)

用滅菌處理過的牙簽從-80 ℃保藏的甘油管中刮取少量所要篩選的海洋細(xì)菌冰塊于相應(yīng)的海洋細(xì)菌培養(yǎng)基上，待碎冰融化，水分完全被瓊脂平板吸附后，使用接種環(huán)將細(xì)菌劃線分離單菌落，置于20～28 ℃不等的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待單菌落長出后，分別挑取海洋細(xì)菌單菌落于相應(yīng)搖瓶培養(yǎng)基中，分別于20～28 ℃不等溫度搖床培養(yǎng)2～7 d，待用。

1.3.3 抗油菜菌核病海洋細(xì)菌的篩選

(1)初篩。采用瓊脂孔擴(kuò)散法[8]篩選活性菌株。提前將活化好的病原真菌菌塊接于PDA平板中央，在距平板中央病菌塊周圍等距離處打孔，在孔中加入20 μL的待測菌液上清，25 ℃培養(yǎng)1～2 d，觀察結(jié)果并測量抑菌圈大小，每組3個重復(fù)，取平均值。

(2)復(fù)篩。通過初篩測定有活性的菌株，采用平板對峙培養(yǎng)法繼續(xù)篩選2～3次，直至最后確定初篩得到菌株的活性。

1.3.4 拮抗假單胞菌活性物質(zhì)的分子檢測

對篩選得到的部分假單胞菌株進(jìn)行活性物質(zhì)的分子檢測，利用如表1中的特異性引物[9～11]對所挑選的19株活性假單胞菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，硝吡咯菌素(Pyrrolnitrin，Prn)合成相關(guān)基因prnD的引物為PRND1和PRND2，陽性對照為P.fluorescensCHA0和P.fluorescensPf-5；2，4-二乙?；g苯三酚(2，4-DAPG)合成相關(guān)基因phl的引物為PhlD1和PhlD2，陽性對照為P.fluorescensQ8r1-96；吩嗪(Phenazine，PCA))合成相關(guān)基因phzl的引物為PHZ1和PHZ2，陽性對照為P.fluorescens2-79；藤黃綠膿菌素(Pyoluteorin，Plt)合成相關(guān)基因pltC的引物為PLTC1和PLTC2，陽性對照為P.fluorescensPf-5。具體反應(yīng)條件如下：采用25 μL體系：模板DNA 1 μL，上下游引物(10 pmol·L-1)各1 μL，2×Taq PCR mastermix(含染料)12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，Tm值退火45 s，72 ℃延伸1 min，計30次循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃ forever。PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

挑選目的菌株，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，連接T載體，挑選陽性轉(zhuǎn)化子送至上海英駿生物技術(shù)有限公司(Invitrogen)測序。

表1 PCR反應(yīng)特異性引物序列

2 結(jié)果與討論

2.1 抗油菜菌核病的海洋細(xì)菌篩選結(jié)果

以油菜菌核盤菌為指示菌，總計篩選了1021株海洋來源的細(xì)菌菌株，分屬于168個屬，最終篩選得到144株活性菌株，屬于40個屬，占總篩選菌株數(shù)的14.1%、總篩選屬數(shù)的23.8%。篩選的1021株海洋菌株主要集中在假單胞菌屬(Pseudomonassp.)、假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonassp.)、芽孢桿菌屬(Bacillussp.)、交替單胞菌屬(Alteromonassp.)、食烷菌屬(Alcanivoraxsp.)、微桿菌屬(Microbacteriumsp.)等，分別占總篩選菌株數(shù)的29.6%、7.1%、7.1%、3.9%、3.8%、2.6%(見表2)，另外還包括占總篩選菌株數(shù)32.3%的共計330株其它稀有來源的海洋菌屬，如：貝爾曼氏菌屬(Bermanellasp.)、比齊奧氏菌屬(Bizioniasp.)、棲海膽菌屬(Echinicolasp.)、生菌絲菌屬(Myceligeneranssp.)、赫夫勒氏菌(Hoefleasp.)、預(yù)研菌屬(Yokenellasp.)、滇微所菌屬(Yimellasp.)、居綠藻菌屬(Ulvibactersp.)、斯塔普氏菌屬(Stappiasp.)、芽孢八疊球菌屬(Sporosarcinasp.)等。

表2 拮抗油菜菌核病病原真菌的海洋細(xì)菌

其中篩選得到的活性菌株中包含假單胞菌屬(Pseudomonassp.)共計50株，占總活性菌株數(shù)的34.7%；芽孢桿菌屬(Bacillussp.)共計34株，占總活性菌株數(shù)的23.6%；科貝特氏菌屬(Cobetiasp.)共計6株，占總活性菌株數(shù)的4.2%；鹽單胞菌屬(Halomonassp.)共計5株，占總活性菌株數(shù)的3.5%；食烷菌屬(Alcanivoraxsp.)共計4株，占總活性菌株數(shù)的2.8%；微桿菌屬(Microbacteriumsp.)共計3株，占總活性菌株數(shù)的2.1%；其它屬共計38株，占總活性菌株數(shù)的26.4%。

1021株海洋細(xì)菌中總計篩選海洋假單胞菌株302株，得到50株活性菌株，活性菌株的比例為16.6%，主要分布在銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)、殺香魚假單胞菌(P.plecoglossicida)、摩氏假單胞菌(P.mosselii)、氧化吲哚假單胞菌(P.indoloxydans)、施氏假單胞菌(P.stutzeri)等種中(見表3)，其中尤其以不同來源的銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)菌株中活性菌株幾率最高，總共篩選了13株銅綠假單胞菌，其中12株對油菜菌核病有抑制活性，篩得率高達(dá)92.3%，且12株銅綠假單胞菌對油菜菌核病抑制效果顯著，抑菌圈直徑平均在20 mm以上。

表3 拮抗油菜菌核病病原真菌的海洋假單胞菌

2.2 拮抗假單胞菌活性物質(zhì)產(chǎn)生分析

利用特異性引物對篩選得到的19株活性假單胞菌(表4)進(jìn)行活性物質(zhì)的分子檢測，其PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

圖1 19株活性假單胞菌產(chǎn)活性物質(zhì)分子檢測圖

由圖1可知，菌株1A00318和SH-46以及陽性對照P.fluorescensCHA0、P.fluorescensPf-5經(jīng)硝吡咯菌素合成基因的引物PRND1和PRND2擴(kuò)增得到了大小約為786 bp的片段；菌株1A06832和SH-46以及陽性對照菌株P(guān).fluorescensCHA0、P.fluorescensQ8r1-96、P.fluorescensPf-5經(jīng)2，4-DAPG合成基因的引物PhlD1和PhlD2擴(kuò)增得到了大小約為629 bp的片段；菌株1A04311、1A05429和1A01321以及陽性對照P.fluorescens2-79經(jīng)吩嗪合成基因的引物PHZ1和PHZ2擴(kuò)增得到了大小約為1408 bp的片段；菌株1A06832、1A00318和SH-46以及陽性對照P.fluorescensCHA0、P.fluorescensPf-5經(jīng)藤黃綠膿菌素合成基因的引物PLTC1和PLTC2擴(kuò)增得到了大小約為438 bp的片段。

表4 19株活性假單胞菌及陽性對照菌株信息

將Pseudomonassp.1A00318和SH-46、對照P.fluorescensPf-5經(jīng)硝吡咯菌素合成基因擴(kuò)增獲得的目的片段(如圖2)進(jìn)行測序分析，證明不是硝吡咯菌素合成基因，表明19株假單胞菌中沒有發(fā)現(xiàn)硝吡咯菌素合成基因。

14.P.fluorescens Pf-5 21.1A00318 22.SH-46

3 結(jié)論

(1)以油菜核盤菌為病原指示菌，總計篩選了來自168個不同屬的1021株海洋來源細(xì)菌菌株，最終得到144株活性菌株，篩得率為14.1%。在篩選菌株超過20株以上的屬中，發(fā)現(xiàn)活性菌株篩得率最高的屬分別是芽孢桿菌屬(46.6%)和假單胞菌屬(16.6%)。

(2)通過比較篩選的302株海洋假單胞菌中的50株活性菌株，發(fā)現(xiàn)各個種之間差異明顯，其中以不同來源的銅綠假單胞菌活性菌株篩得率和活性最高。

對其中具有較強(qiáng)抗菌活性的19株假單胞菌進(jìn)行了產(chǎn)活性物質(zhì)合成基因的分子檢測，結(jié)果表明，菌株1A06832和SH-46擴(kuò)增獲得了2，4-二乙酰基間苯三酚合成基因的目的片段；菌株1A04311、1A05429和1A01321擴(kuò)增獲得了吩嗪合成基因的目的片段；1A06832、1A00318和SH-46擴(kuò)增獲得了藤黃綠膿菌素合成基因的目的片段；而硝吡咯菌素合成基因片段沒有獲得。

(致謝：感謝國家自然科學(xué)基金資助，感謝國家海洋局第三海洋研究所海洋生物遺傳資源重點實驗室和中國海洋微生物菌種保藏管理中心(MCCC)給予海洋細(xì)菌篩選方面的支持和幫助；特別感謝美國華盛頓州立大學(xué)Root Disease Research Unit課題組提供本研究所需的陽性對照菌株。)

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