雙水相萃取技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展

范 芳

(廣東石油化工學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，廣東 茂名 525000)

雙水相萃取是利用組分在兩個互不相溶的水相中的溶解度不同而達(dá)到分離的萃取技術(shù)。雙水相萃取技術(shù)的真正應(yīng)用是在20世紀(jì)中葉，1956年，瑞典倫德大學(xué)的Albertsson成功地利用雙水相體系分離葉綠素，解決了蛋白質(zhì)變性和沉淀的問題[1]。1979年，德國Kula等將雙水相萃取技術(shù)應(yīng)用于生物酶的分離，為以后雙水相萃取技術(shù)在生物蛋白質(zhì)、酶分離純化方面的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)[2]。迄今為止，雙水相萃取技術(shù)已被成功應(yīng)用于生物工程、藥物提取、金屬離子分離等方面。盡管其已發(fā)展成為一種相對比較成熟的技術(shù)，但仍然有值得深入研究與完善的方面。作者在此主要介紹了雙水相萃取的基本要點及應(yīng)用特點，綜述了雙水相萃取技術(shù)在生物工程、藥物成分提取分離等方面的應(yīng)用。

1 雙水相萃取的基本要點

1.1 雙水相萃取的原理

雙水相萃取與水-有機相萃取的原理相似，都是依據(jù)物質(zhì)在兩相間的選擇性分配，但萃取體系的性質(zhì)不同。當(dāng)物質(zhì)進(jìn)入雙水相體系后，由于表面性質(zhì)、電荷作用和各種力(如憎水鍵、氫鍵和離子鍵等)的存在和環(huán)境的影響，使其在上、下相中的濃度不同。對于某一物質(zhì)，只要選擇合適的雙水相體系，控制一定的條件，就可以得到合適的分配系數(shù)，從而達(dá)到分離純化之目的[3]。

1.2 雙水相的種類

雙水相萃取中使用的雙水相是由兩種互不相溶的高分子溶液或者互不相溶的鹽溶液和高分子溶液組成。最常見的就是聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(Dextran)和PEG/無機鹽(硫酸鹽、磷酸鹽等)體系，其次是聚合物/低分子量組分、離子液體體系和高分子電解質(zhì)/高分子表面活性劑體系。此外，還有被稱為智能聚合物的雙水相體系，智能聚合物又稱刺激-響應(yīng)型聚合物(Stimulus-responsive polymers)或環(huán)境敏感聚合物(Environmentally-sensitive polymers)。智能聚合物是一種功能高分子材料，當(dāng)外界環(huán)境(如溫度、pH值、離子強度、外加試劑、光、電場或磁場等)發(fā)生微小變化時，聚合物分子的微觀結(jié)構(gòu)會發(fā)生快速、可逆的轉(zhuǎn)變，使其從親水性變?yōu)槭杷?。智能聚合物的雙水相體系有：溫度敏感型雙水相體系、酸度敏感型雙水相體系、光響應(yīng)型雙水相體系、親和功能雙水相體系[4]。

2 雙水相萃取技術(shù)的特點

雙水相萃取技術(shù)設(shè)備簡單、在溫和條件下進(jìn)行簡單操作就可獲得較高的收率和純度。與一些傳統(tǒng)的分離方法相比，雙水相萃取技術(shù)具有以下特點[5，6]：

(1)雙水相體系中的傳質(zhì)和平衡速度快，回收率高，分相時間短，自然分相時間一般為5～15 min，相對某些分離過程，可以實現(xiàn)快速分離，且能耗較低。

(2)兩相間的界面張力小，一般為1×10-7～1×10-4mN·m-1，比一般的有機萃取兩相體系界面張力(1×10-3～2×10-2mN·m-1)低得多，因此兩相易分散，有利于強化相際間的物質(zhì)傳遞，整個操作過程可以在常溫常壓下進(jìn)行，不會引起生物活性物質(zhì)失活或變性。

(3)分離過程更經(jīng)濟，與常用固液分離方法相比，可省去1～2個分離步驟。

(4)兩相的溶劑都是水，上相和下相的含水量高達(dá)70%～90%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，不存在有機溶劑殘留問題。

(5)聚合物的濃度、無機鹽的種類和濃度以及體系的pH值等因素都對被萃取物質(zhì)在兩相間的分配產(chǎn)生影響，因此，可以采用多種手段來提高選擇性和回收率。

(6)易于連續(xù)化操作，設(shè)備簡單，并且可直接與后續(xù)提純工序相連接，無需進(jìn)行特殊處理。例如可以采用高分配系數(shù)和高選擇性的多級逆流分配操作。

3 雙水相萃取技術(shù)的應(yīng)用

雙水相萃取技術(shù)越來越受到人們的青睞，廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)學(xué)、環(huán)境科學(xué)等各大領(lǐng)域，近三年來，雙水相萃取技術(shù)的應(yīng)用更加頻繁。

3.1 生物工程

3.1.1 萃取分離酶

已有較多報道采用雙水相萃取技術(shù)分離各種酶，如蛋白酶、木聚糖酶、Geotrichumsp·SYBCWU-3脂肪酶、低溫α-淀粉酶、殼聚糖酶、纖維素酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶、氯過氧化物酶等。

張?zhí)m威等[7]采用雙水相萃取技術(shù)分離提取風(fēng)干香腸中蛋白酶，確定雙水相體系組成(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為PEG1000 20%和MgSO425%，在此體系中風(fēng)干香腸的蛋白酶主要分布在上相，最高酶活為12.37 U·μg-1，純化倍數(shù)為4.61，回收率為85%。

蘇玉春等[8]采用雙水相萃取法從黑曲霉AS3.4309的發(fā)酵液中提取木聚糖酶，得到雙水相體系的最佳組成：選用PEG4000，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為19%，磷酸氫二鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%。在此條件下，木聚糖酶的提取效果較好，分配系數(shù)和上相產(chǎn)率分別為6.23和88.67%。

王蕾等[9]確定雙水相萃取體系為：PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%、NaH2PO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%、pH值6，在此條件下Geotrichumsp·SYBCWU-3脂肪酶經(jīng)硫酸銨沉淀和雙水相萃取兩步純化的純化倍數(shù)達(dá)到最大，較Geotrichumsp·SYBCWU-3脂肪酶粗酶純化了22倍。Geotrichumsp·SYBCWU-3脂肪酶純酶為低溫堿性脂肪酶，最適反應(yīng)溫度為15 ℃，最適pH值為9.5，相對分子質(zhì)量為3.58×104。

房耀維等[10]利用聚乙二醇/磷酸鹽雙水相體系從PseudoalteromonasarcticGS230發(fā)酵液中直接萃取分離低溫α-淀粉酶。結(jié)果表明，在pH值5.0的15% PEG1000/15%磷酸鹽雙水相體系中，低溫α-淀粉酶的純化倍數(shù)及回收率分別為4.8和87%。

周念波等[11]采用PEG600/(NH4)2SO4雙水相體系直接從Bacillussp.LS發(fā)酵液上清液中分離殼聚糖酶。得到室溫下雙水相萃取最佳條件為：PEG600 20%、(NH4)2SO420%、NaCl 0.1%、pH值6.0，在此條件下，殼聚糖酶分配系數(shù)達(dá)5.91，萃取率達(dá)88.7%。

舒國偉等[12]利用PEG4000/(NH4)2SO4雙水相體系萃取纖維素酶。結(jié)果表明，雙水相體系的組成(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為(NH4)2SO48%、PEG4000 26%、pH值4.8時，分配系數(shù)為5.21，萃取率為79.4%。

張娟等[13]研究了果膠酶的雙水相萃取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在雙水相體系組成(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為PEG1000 27%、硫酸銨19%、氯化鈉0.002%、pH值5.0時，果膠酶的萃取效率較好，分配系數(shù)最高達(dá)14.0。

陳利梅等[14]采用雙水相體系對葡萄糖氧化酶進(jìn)行萃取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葡萄糖氧化酶在25% PEG4000和10%硫酸銨的雙水相體系中可獲得較高的萃取率，達(dá)81.11%，分配系數(shù)為0.134。

朱旭國等[15]利用親水聚合物PEG6000在高離子強度下失水沉淀夾帶酶蛋白的特點，結(jié)合PEG/(NH4)2SO4雙水相萃取得到高濃度酶蛋白，再經(jīng)SephadexG-75柱層析純化得到高純度酶樣品。結(jié)果表明，飽和度60%的(NH4)2SO4溶液可使PEG6000夾帶沉淀出總酶活力95%的氯過氧化物酶，酶在PEG/(NH4)2SO4雙水相體系中上下相分配率達(dá)到0.228以下，回收率達(dá)到65.2%，純度提高了7.4倍。

3.1.2 萃取分離蛋白質(zhì)

近幾年來，已經(jīng)成功地利用雙水相萃取技術(shù)分離出牛血清白蛋白、藻藍(lán)蛋白、藻膽蛋白、血紅蛋白等。

王軍等[16]研究了新型離子液體N-乙基-N-丁基嗎啉四氟硼酸鹽([Nebm]BF4)和KH2PO4形成的雙水相體系對牛血清白蛋白(BSA)的萃取行為，結(jié)果表明，當(dāng)KH2PO4的加入量為85 g·L-1、離子液體濃度為200～250 g·L-1、BSA的濃度為60～120 mg·L-1、溶液pH值為4.5～7.0時，萃取率達(dá)98.0%以上。

王巍杰等[17]確定雙水相體系組成(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為PEG2000 16%、酒石酸鉀鈉25%、pH值6.0，在此體系中藻藍(lán)蛋白主要分布在上相，最高純化倍數(shù)為3.69，分配系數(shù)為20.7，回收率為94.56%。多次雙水相萃取有利于藻藍(lán)蛋白純度提高，3次雙水相萃取后，藻藍(lán)蛋白純化倍數(shù)高達(dá)4.15。

謝云飛等[18]應(yīng)用雙水相體系分離血紅蛋白(HB)。結(jié)果表明，最佳PEG雙水相體系為：PEG400質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%、(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%、pH值7、溫度30 ℃。在此條件下，HB分配系數(shù)達(dá)到65，回收率達(dá)到89.5%，純度達(dá)到80.5%。

3.1.3 萃取分離小分子物質(zhì)

雙水相萃取技術(shù)除了能分離大分子物質(zhì)外，還可以萃取分離小分子物質(zhì)，如萃取大豆苯丙氨酸、發(fā)酵液中谷胱甘肽等。

孫晨等[19]采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)和十二烷基硫酸鈉(SDS)表面活性劑形成雙水相體系，研究了大豆蛋白水解液中L-苯丙氨酸在CTAB/SDS雙水相體系中的分配及萃取效果。結(jié)果表明，當(dāng)雙水相體系CTAB與SDS摩爾比為0.256、提取液初始苯丙氨酸濃度為0.02 g·L-1、Na2SO4濃度為0.23 mol·L-1時，萃取率最高，達(dá)96.9%。

吳祥庭等[20]選用PEG/四水合酒石酸鉀鈉雙水相體系提取發(fā)酵液中谷胱甘肽，確定最佳提取條件為：15% PEG/13%四水合酒石酸鉀鈉雙水相溶液10 mL、pH值6.7、溫度63 ℃、發(fā)酵液加入量1 mL。此時谷胱甘肽分配系數(shù)為3.5，萃取率為84.13%。

3.1.4 萃取分離抑制劑

α-淀粉酶抑制劑可以用來治療糖尿病、肥胖癥以及合成干擾內(nèi)源性甘油三酯，還可以用作殺蟲劑。研究人員成功地利用雙水相萃取技術(shù)從白蕓豆及銀針茶中分離純化出α-淀粉酶抑制劑。

張佰鵬等[21]確定白蕓豆中α-淀粉酶抑制劑提取的最佳條件為：PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)12.0%、(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)13.3%、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.003%，在此條件下，分配系數(shù)、相比和活力回收率分別為4.40、0.57、71.41%。

彭佳黛等[22]研究了PEG2000/(NH4)2SO4雙水相體系分離銀針茶α-淀粉酶抑制劑，結(jié)果表明，α-淀粉酶抑制劑主要分配于上相，當(dāng)PEG2000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16%、(NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14%、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.0013%時，α-淀粉酶抑制劑的萃取率最大。

3.2 醫(yī)藥學(xué)

雙水相萃取技術(shù)已經(jīng)悄然滲透到藥物成分的分離中，如萃取三七皂苷、四環(huán)素、橙皮苷、杜仲黃酮、燈盞花素、桃葉珊瑚甙、蘆薈蒽醌、青霉素等，其最佳提取條件如表1所示。

表1 雙水相體系提取藥物成分

3.3 環(huán)境科學(xué)

當(dāng)水中含過量的鋅、鉛、鉻等金屬元素時，嚴(yán)重影響生態(tài)平衡；含有酚類時，引起農(nóng)作物的減產(chǎn)甚至枯死；含土霉素等抗生素藥物時，通過生物富集對生態(tài)系統(tǒng)造成危害。通過雙水相體系可以測定水中酚類、土霉素、鋅、鉛、鉻等物質(zhì)的含量。

曹文等[31]將丙醇/硫酸銨雙水相體系應(yīng)用于焦化廠廢水中酚類物質(zhì)的萃取分離。對于50.0 mL含酚廢水，最佳硫酸銨用量為18.0 g、正丙醇用量為30 mL。

張星剛等[32]采用聚乙二醇/無水硫酸鈉雙水相體系萃取光度法測定鋅，結(jié)果表明，當(dāng)PEG2000溶液用量為4.5 mL、緩沖溶液pH值為7.4時，萃取率最高。還通過研究二苯碳酰二肼(DPC)-鉻(Ⅵ)配合物在PEG2000/Na2SO4雙水相體系中的顯色和萃取分離條件，建立了集萃取分離和Cr6+測定于一身的雙水相萃取光度分析方法。結(jié)果表明，PEG2000溶液用量為4.0～6.0 mL、Na2SO4用量為1.2 g、DPC用量為0.5 mL時，效果最佳。

3.4 與其它技術(shù)結(jié)合應(yīng)用

雙水相萃取技術(shù)有其獨有的優(yōu)點，如能與其它技術(shù)結(jié)合應(yīng)用，萃取分離效果更佳。雙水相萃取技術(shù)與超聲波、微波、殼聚糖沉淀相結(jié)合應(yīng)用的研究已經(jīng)比較成熟，其中與超聲波分離技術(shù)結(jié)合應(yīng)用得最多，具體情況如表2所示。

表2 雙水相萃取與其它技術(shù)結(jié)合應(yīng)用

4 結(jié)語

雙水相萃取技術(shù)是近年來新發(fā)展起來的分離技術(shù)，所需設(shè)備簡單、條件溫和、易于操作，且可以獲得較高的收率和較純的有效成分，與常規(guī)的有機溶劑萃取技術(shù)相比較，最大的優(yōu)勢在于可保持生物物質(zhì)的活性及構(gòu)象，因此在生物工程、藥物分析、環(huán)境科學(xué)等方面有著廣闊的應(yīng)用前景。然而，相關(guān)研究和應(yīng)用還不夠深入，一些技術(shù)難題還有待解決。雙水相萃取技術(shù)的發(fā)展趨勢為：(1)解決易乳化、相分離時間長、成相聚合物的成本較高、水溶性高聚物粘度較大且不易定量控制等問題；(2)開發(fā)新型優(yōu)質(zhì)的雙水相體系；(3)進(jìn)一步拓寬應(yīng)用領(lǐng)域；(4)與其它技術(shù)結(jié)合的多元化利用。

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