不同方法提取海螵蛸多糖及結(jié)構(gòu)表征

唐麗娟， 劉瑋煒， 王 麗， 陳潔林

(淮海工學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院，江蘇連云港222005)

海螵蛸是一味傳統(tǒng)海洋中藥，為烏賊科Sepiidae海洋動(dòng)物無(wú)針烏賊Sepiella maindionide Rochebrune或金烏賊Sepia esculenta Hoyle的干燥內(nèi)殼。海螵蛸的藥用價(jià)值早見于《本經(jīng)》、《本草綱目》等古代藥學(xué)巨著，記載海螵蛸具收斂、止酸、止血、澀精止帶、斂瘡等功效［1］。近年來，許多中外學(xué)者運(yùn)用現(xiàn)代方法對(duì)海螵蛸的藥理作用和臨床應(yīng)用進(jìn)行了研究。證實(shí)海螵蛸具有抗胃潰瘍［1-2］、成骨［3-4］、凝血［5］等作用。然而其作用機(jī)理尚不十分明確，就海螵蛸粉治療胃潰瘍等消化性潰瘍疾病來說，目前臨床研究認(rèn)為與海螵蛸中主要成分碳酸鈣［6］有關(guān)，能保護(hù)胃黏膜或抑制胃蛋白酶活性等［7-8］。然而海螵蛸中含有黏液、多糖及酶等物質(zhì)［9］，魏江洲等［10］水提法獲得海螵蛸多糖并進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，闡明了海螵蛸作為潰瘍用藥的藥物作用機(jī)制。在文獻(xiàn)基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)利用連云港產(chǎn)海螵蛸為研究材料分別采用水提法和堿提法提取多糖，并通過紅外譜圖對(duì)多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征分析。此研究工作為海螵蛸資源的深入研究及中成藥開發(fā)提供了一定的理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料、試劑和儀器

1.1.1 原料 新鮮海螵蛸(江蘇連云港產(chǎn)，購(gòu)于連云港新浦區(qū)蒼梧生活廣場(chǎng))，經(jīng)江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室閻斌倫主任鑒定為金烏賊(Sepia esculenta Hoyle)內(nèi)殼。

1.1.2 試劑和儀器 乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、苯酚等均為國(guó)產(chǎn)分析純。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，722S可見分光光度計(jì)(上海菁華科技儀器有限公司)，WGH-30/6型雙光束紅外分光光度計(jì)(天津市港東科技發(fā)展有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水提法提取海螵蛸粗多糖 將新鮮海螵蛸洗凈晾干后研成粉末(過200目篩)，先用95%乙醇攪拌浸泡24 h，殘?jiān)?.5 mol/L的鹽酸常溫浸泡24 h(其間強(qiáng)力攪拌)，抽濾，熱水?dāng)嚢杞釣V渣，抽濾，殘?jiān)貜?fù)提取兩次，合并3次水提液。濃縮水提液至原來體積的一半，6000 r/min離心10 min。上清液用sevage法(三氯甲烷-正丁醇=4∶1)反復(fù)除蛋白3次。濃縮上述提取液，加入2倍體積無(wú)水乙醇，攪拌均勻，室溫靜置過夜，次日，離心棄上清液，將沉淀復(fù)溶于蒸餾水，再離心，棄去不溶物，第2次醇沉，所得沉淀用蒸餾水溶解后透析48 h，透析液冷凍干燥，得海螵蛸多糖粗品，參照文獻(xiàn)［11］苯酚-硫酸法測(cè)多糖量。

1.2.2 堿提法提取海螵蛸粗多糖 將水提后的殘?jiān)?，?.5%氫氧化鈉堿溶液80℃攪拌浸提4 h。將堿提多糖溶液，用2 mol/L的鹽酸溶液中和至pH=7.0，出現(xiàn)渾濁，進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，將濃縮液抽濾，分別收集沉淀與清液，沉淀即為堿提水不溶多糖，干燥后稱質(zhì)量。然后將清液以流動(dòng)水透析24 h，透析結(jié)束后向溶液中加入2～3倍無(wú)水乙醇，4℃下靜置過夜，離心收集沉淀，該沉淀即為堿提水溶多糖［12］，干燥后稱質(zhì)量，計(jì)算兩種多糖總提取率［堿提多糖總提取率=(堿提水不溶多糖質(zhì)量+堿提水溶多糖質(zhì)量)/提取原料質(zhì)量×100%］。

2 結(jié)果與討論

2.1 水提法提取海螵蛸多糖

2.1.1 液固比對(duì)海螵蛸水提多糖量的影響 分別準(zhǔn)確稱取50 g海螵蛸粉末，脫鈣后殘?jiān)匆汗瘫葹?∶1、6∶1、8∶1加入蒸餾水，于70℃提取6 h，測(cè)多糖量。結(jié)果見圖1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明隨著液固比的增加，多糖的提取率并沒有提高反而呈下降趨勢(shì)。在液固比為4∶1時(shí)，多糖提取率最大。而液固比為6∶1或8∶1時(shí)提取率較低，分析其原因可能是由于隨著傳質(zhì)推動(dòng)力的加大，隨多糖一起浸出的雜質(zhì)也增多，但在醇沉?xí)r，這些雜質(zhì)沒有隨多糖一塊沉淀，而且有可能夾雜一些多糖保留在醇溶液中［13］。

圖1 液固比對(duì)水提多糖量的影響

2.1.2 提取溫度對(duì)海螵蛸水提多糖量的影響 50 g海螵蛸粉末脫鈣后殘?jiān)砸汗瘫葹?∶1，分別于70℃、80℃、90℃提取6 h，測(cè)多糖量，見圖2。從圖2看出，溫度對(duì)海螵蛸多糖提取率有顯著的影響。在70℃到80℃時(shí)，隨著溫度的升高，多糖提取率呈逐漸增大趨勢(shì)。之后，隨著溫度的升高，多糖量明顯下降，因此確定80℃時(shí)為較佳的提取溫度。

圖2 提取溫度對(duì)水提多糖量的影響

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)海螵蛸水提多糖量的影響 液固比為4 ∶1，于80 ℃分別提取4 h、6 h、8 h，多糖量測(cè)定結(jié)果見圖3。隨著浸提時(shí)間的增加，多糖的得率并沒有增加趨勢(shì)，6 h多糖得率最高，時(shí)間延長(zhǎng)，導(dǎo)致多糖在提取溫度下發(fā)生結(jié)構(gòu)變化而使多糖有所損失。故提取時(shí)間選取6 h。

圖3 提取時(shí)間對(duì)水提多糖量的影響

2.1.4 水提法重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取海螵蛸粉末3份各100 g，以上述獲得的水提較佳工藝條件即提取溫度80℃，液固比4∶1，提取時(shí)間6 h按1.2.2項(xiàng)進(jìn)行3次平行提取實(shí)驗(yàn)(n=3)，結(jié)果見表1，RSD為4.39%，表明該方法較可靠。

表1 水提多糖重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 堿提法提取海螵蛸多糖

2.2.1 提取時(shí)間對(duì)海螵蛸堿提多糖得率的影響 將水提后的殘?jiān)栏珊蠓Q等量的3份，以0.5%氫氧化鈉堿溶液80℃條件下浸提4 h、6h、8 h，測(cè)定不同提取時(shí)間對(duì)海螵蛸堿提多糖得率的影響。由圖4可知，提取時(shí)間對(duì)提取結(jié)果有一定的影響。提取時(shí)間短如4 h時(shí)，多糖提取率明顯減少。當(dāng)提取時(shí)間達(dá)6 h時(shí)，多糖的提取率達(dá)到較高，繼續(xù)增加時(shí)間反而有所下降，故將多糖的最佳提取時(shí)間定為6 h。

圖4 浸提時(shí)間對(duì)堿提海螵蛸多糖得率的影響

2.2.2 氫氧化鈉溶液質(zhì)量濃度對(duì)海螵蛸堿提多糖得率的影響 將水提后的等量殘?jiān)?，分別以0.5 mol/L、1.0 mol/L、1.5 mol/L、2.0 mol/L不同質(zhì)量濃度氫氧化鈉堿溶液80℃條件下浸提6 h，測(cè)定不同氫氧化鈉溶液質(zhì)量濃度對(duì)海螵蛸堿提多糖提取率的影響，結(jié)果見圖5。隨著稀堿提取質(zhì)量濃度的增加，多糖的提取率逐步增加，當(dāng)堿提質(zhì)量濃度大于1.0 mol/L時(shí)，增幅有減小的趨勢(shì)，當(dāng)堿質(zhì)量濃度大于1.5 mol/L時(shí)，提取率增加趨勢(shì)平緩，可能是因?yàn)閴A溶液質(zhì)量濃度過大而破壞多糖的結(jié)構(gòu)，另外隨著濃度的提高，溶液的黏度不斷增大，給后續(xù)的過濾、離心等環(huán)節(jié)增加不少工藝上困難。因此綜合提取率及操作方便堿質(zhì)量濃度選擇1.5 mol/L。

圖5 堿溶液質(zhì)量濃度對(duì)多糖提取率的影響

2.2.3 提取溫度對(duì)海螵蛸堿提多糖提取率的影響 將水提后的等量殘?jiān)?.5 mol/L氫氧化鈉堿溶液于60℃、80℃、90℃、100℃條件下浸提6 h，測(cè)定不同提取溫度對(duì)海螵蛸堿提多糖提取率的影響，結(jié)果見圖6。由圖6可以看出，在80℃時(shí)多糖的提取率最高，這可能因?yàn)榈蜏貢r(shí)溶液中多糖不能得到充分提取;溫度過高時(shí)，多糖有少量降解為可溶性單糖或低聚糖，而使提取率有所下降。因此選80℃為較佳提取溫度。

圖6 浸提溫度對(duì)海螵蛸多糖的影響

2.2.4 堿提法重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取3份水提后殘?jiān)?00 g，以上述獲得的堿提較佳工藝條件即提取溫度80℃，氫氧化鈉溶液質(zhì)量濃度1.5 mol/L，提取時(shí)間6 h進(jìn)行3次平行提取實(shí)驗(yàn)(n=3)，結(jié)果見表2，RSD為3.87%，表明該方法重復(fù)性較好。

表2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 海螵蛸粗多糖結(jié)構(gòu)表征

水提海螵蛸粗多糖:3492.0 cm－1強(qiáng)而寬吸收峰為多糖O-H 的伸縮振動(dòng)，形成分子內(nèi)氫鍵［14］，2800.0 cm－1小肩峰為C-H的伸縮振動(dòng)，1630.0 cm－1中強(qiáng)吸收峰為C=O伸縮振動(dòng)，1378.0 cm－1為 C-H 的彎曲振動(dòng)，1100.0 cm－1的峰即C-O伸縮振動(dòng)，562.0 cm－1為O-H面外彎曲振動(dòng)。

堿提水溶性多糖:3408.0 cm－1為多糖O-H的伸縮振動(dòng);1582.0 cm－1為 C=O 伸縮振動(dòng);1350.0 cm－1為 C-H 彎曲振動(dòng)，1254，1106.0 cm－1是 C-O 伸縮振動(dòng)。

堿提水不溶多糖:3292.0 cm－1為O-H伸縮振動(dòng)，形成分子間氫鍵;2928.0 cm－1是 C-H 伸縮振動(dòng);1582.0 cm－1C=O伸縮振動(dòng);1358.0糖環(huán)亞甲基C-H彎曲振動(dòng);1070.0 cm－1是C-O伸縮振動(dòng)，在772.0 cm－1處的吸收則為吡喃對(duì)稱環(huán)的伸縮振動(dòng)。

從以上各種多糖的紅外譜圖分析可以看出，經(jīng)水提和堿提獲得的3種提取物均有多糖特征，如均在3600～3200 cm－1區(qū)域形成寬而強(qiáng)的峰，歸屬為糖分子中羥基的伸縮振動(dòng);分別在 1630.0，1582.0，1582 cm－1表現(xiàn)出酰胺Ⅰ帶和Ⅱ帶的吸收峰，表明多糖提取物中均可能存在酰胺基;在1200，1100 cm－1附近的吸收峰為C-O伸縮振動(dòng)的吸收峰，是糖環(huán)的醚鍵(C-O-C)和羥基的吸收峰，表明粗多糖均可能存在糖環(huán)內(nèi)醚結(jié)構(gòu)。

但各多糖結(jié)構(gòu)不完全相同，首先氫鍵類型不同:水提多糖和堿提多糖是分子內(nèi)氫鍵，而堿提水不溶性多糖是分子間氫鍵。另外糖環(huán)類型可能不同。在IR譜圖 中只有堿提水不溶性多糖在772.0 cm－1出現(xiàn)了吸收峰，表明其糖環(huán)可能是吡喃環(huán)構(gòu)型。因此從紅外光譜數(shù)據(jù)可以初步判斷海螵蛸水提多糖和堿提多糖均具有多糖特征，但各多糖結(jié)構(gòu)間存在著一定的差異。

3 結(jié)論

在水提法基礎(chǔ)上，以堿提法提取江蘇連云港產(chǎn)金烏賊海螵蛸中多糖。確定了水提法提取海螵蛸多糖的較佳工藝條件為提取溫度80℃，液固比4∶1，提取時(shí)間6 h得到多糖量約為1‰。海螵蛸堿提多糖的最佳工藝條件為:提取溫度80℃，氫氧化鈉溶液質(zhì)量濃度1.5 mol/L，提取時(shí)間6 h，多糖提取率約為7.008‰。海螵蛸水提粗多糖和堿提粗多糖均具有多糖紅外光譜特征峰，水溶性多糖和堿提水溶性多糖紅外譜圖數(shù)據(jù)相似，堿提水不溶性多糖與前二者有一定差異。海螵蛸是傳統(tǒng)海洋中草藥，目前限于海螵蛸粉末的制劑配方，成分療效不明確。因此本實(shí)驗(yàn)采用不同的提取方法獲得水提多糖和堿提多糖，為海螵蛸資源的深入研究及中成藥的開發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

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