樹脂吸附法分離純化鎖陽中熊果酸的工藝研究

李貴文， 張明芮

(皖南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，安徽蕪湖241002)

鎖陽又名不老藥、銹鐵棒、地毛球、羊鎖不拉［1］，是鎖陽科植物鎖陽Cynomorium songaricum Rupr.的干燥肉質(zhì)莖，具有補腎陽、益精血、潤腸通便的作用，臨床上主要用于腰膝痿軟、陽萎滑精、腸燥便秘等證。鎖陽還在防癌、抗癌、免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)、延緩衰老、防治心血管疾病、治療白細(xì)胞減少等方面有明顯的效果［2-4］。鎖陽含多種化學(xué)成分及藥用成分，其中，熊果酸是一種三萜類化合物，具有鎮(zhèn)靜、抗炎、抗菌、抗?jié)兊榷喾N生物學(xué)效應(yīng)，熊果酸還具有明顯的抗氧化功能，因而被廣泛地用作醫(yī)藥和化妝品原料［5］。

傳統(tǒng)醇提法得到的提取液中熊果酸量較低，不能很好的發(fā)揮熊果酸的藥用價值。大孔吸附樹脂具有吸附性強，解吸附容易，機械強度好，可反復(fù)使用和流體阻力小等優(yōu)點。近年來大孔吸附樹脂在天然藥物化學(xué)成分的提取、分離純化、制劑工藝改革、制劑質(zhì)量分析等方面有了較廣泛的應(yīng)用研究［6］。本實驗采用多種型號的大孔吸附樹脂研究熊果酸的吸附和解析性能，篩選出最佳的樹脂，并對影響吸附和解析的一系列工藝參數(shù)進行了研究。

1 儀器與試藥

JASCO日本分光公司LC-2000高效液相色譜儀;PU-2086高壓色譜泵;UV-2075紫外檢測器;色譜工作站(HPLC-2000);色譜柱 HiQsil C18W(4.6 mm ×250 mm);玻璃層析柱￠10 mm×300 mm(美國Amersham Biosciences公司);X-5、D101、D1400、AB-8、DM130、DM301、DA201、NKA-9 大孔吸附樹脂(天津市海光化工有限公司);ME235S電子分析天平(德國Sartorius賽多利斯);TDL-5離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠);PHS-4CT型精密酸度計(上海大普儀器有限公司)等。甘肅產(chǎn)優(yōu)質(zhì)鎖陽;熊果酸對照品(批號:110742-200516，中國食品藥品檢定研究院);色譜甲醇;其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 鎖陽中熊果酸測定方法

2.1.1 色譜條件的確定 以保留時間定性，峰面積定量。根據(jù)文獻(xiàn)［7］確定最佳色譜條件如下:流動相為甲醇－0.02 mol/L磷酸二氫鈉(75∶25)，體積流量1 mL/min，檢測波長220 nm;經(jīng)精密度(RSD為0.37%)和加樣回收率(98.6%)實驗，表明儀器精密度良好。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取一定量的熊果酸對照品，置于250 mL量瓶中，加入流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻即得(8.74 μg/mL)。熊果酸對照品色譜保留值11.671。

2.1.3 樣品測定 分別精密吸取熊果酸對照品溶液(經(jīng)微孔濾膜過濾)5、7.5、10、12.5、15 μL 注入高效液相色譜儀，測定熊果酸峰面積積分值。以峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，熊果酸進樣量(X)為橫坐標(biāo)進行線性回歸，求得回歸方程Y=4170000X －11573(r=0.9998，n=5)，表明熊果酸質(zhì)量在0.0437～0.1311 μg之間有良好線性關(guān)系。取供試品溶液，經(jīng)稀釋，微孔濾膜過濾后，進樣10 μL，測定熊果酸峰面積積分值(Y)，代入回歸方程計算熊果酸濃度。

2.2 樣品中熊果酸測定［7］精密稱取樣品粉末(60目)約1 g，加入20 mL無水乙醇冷浸1 h后，用無水乙醇超聲提取3次［20 mL(20 min)，15 mL(20 min)，10 mL(10 min)］，第 1次超聲時用冷浸液，不再加無水乙醇。合并提取液濾過，置50 mL量瓶中，用無水乙醇定容。精密吸取2 mL置10 mL量瓶中，將無水乙醇揮干后，用流動相定容。經(jīng)微孔濾膜過濾后，依上述色譜條件分析。平行進行三組實驗，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.726%。對照品及樣品色譜圖見圖1。

圖1 熊果酸對照品及樣品HPLC色譜圖

2.3 上柱溶液的制備［8］稱取一定量的鎖陽粉，用最佳提取條件提取熊果酸。提取液離心，取上清液濃縮回收乙醇后進行醇沉，除去多糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。再減壓回收乙醇至無醇味，繼續(xù)依次加入石油醚、二氯甲烷萃取，以除去鎖陽中的色素和其他脂溶性雜質(zhì)。將粗提物溶于蒸餾水，制成靜態(tài)、動態(tài)吸附所需要的多種濃度。

2.4 靜態(tài)吸附解析實驗［9］

2.4.1 吸附量的測定 精確稱取樹脂1 g，處理后加入具塞錐形瓶中。精密加入熊果酸質(zhì)量濃度2.27 mg/mL的上柱液100 mL，室溫下震蕩吸附24 h，取樣分析，按下式計算吸附量(Q)。

Q(mg/g樹脂)=(C0－Ce)×V/W

式中:C0—起始質(zhì)量濃度，Ce—平衡質(zhì)量濃度

V—吸附液體積，W—樹脂質(zhì)量

2.4.2 洗脫率的測定 將吸附了熊果酸的樹脂濾過，用水洗滌，置于具塞錐形瓶中，加入90%的乙醇100 mL，室溫下震蕩解析24 h，取樣分析，按下式計算解析率(D)。

D(%)=CDVD/［(C0－Ce)×V］×100

式中:CD—解析液質(zhì)量濃度;VD—解析液體積

2.4.3 樹脂的篩選 按照使用方法將樹脂處理好，備用［10］。8種樹脂在相同條件下對鎖陽提取液中熊果酸的吸附量和解析率見表1。由表1可知DM130樹脂的吸附量與解析率都較高，這與樹脂的性質(zhì)和熊果酸的性質(zhì)密切相關(guān)，DM130樹脂具有弱極性且比表面積也比較大，因而適于吸附非極性和弱極性的化合物，而熊果酸本身屬于弱極性分子因而吸附量較高。雖然NKA-9的吸附量更高，但是由于極性較大，分子間作用力較強因而不宜解析。故選擇DM130樹脂進行進一步的實驗。

表1 樹脂的主要特征

2.5 DM130樹脂對熊果酸的吸附性能［9］

2.5.1 靜態(tài)吸附動力學(xué)過程 將一定量樹脂放入上柱液中，使其充分吸附達(dá)到飽和，測定含量(平行測定2次，取平均值)。以吸附時間為橫坐標(biāo)，吸附量為縱坐標(biāo)作出熊果酸在DM130樹脂上的吸附動力學(xué)曲線。由圖2可見，初始階段吸附速率較快，100 min后吸附量增加緩慢，160 min后已基本達(dá)最大吸附量。

圖2 吸附量隨時間的變化

2.5.2 上柱液質(zhì)量濃度對吸附性能的影響 取相同量的樹脂，分別放入不同質(zhì)量濃度的上柱液中使吸附達(dá)飽和，平行測定2次，取平均值。由圖3可見濃度過低，過高都不利于吸附的進行，質(zhì)量濃度過低樹脂處理量大但需時較長，效率低;過高不利于吸附的進行，在初始質(zhì)量濃度1.4～1.8 mg/mL之間吸附量達(dá)飽和。

圖3 吸附量隨上柱液質(zhì)量濃度的變化

2.5.3 上柱液pH值對吸附性能的影響 稱取相同量的樹脂，分別放入不同pH值的上柱液中使吸附達(dá)到飽和，平行測定2次，取平均值。由圖4可知在pH 5.7左右吸附量最大，pH過低熊果酸以佯鹽形式存在，不利于其吸附，過高則以離子形式存在，極性增強，也不利于被弱極性的樹脂吸附，

故選擇pH 5.70作為最佳pH。

圖4 吸附量隨上柱液pH值的變化

2.5.4 上柱液體積流量對吸附的影響 在最佳上柱液濃度和pH條件下分別以1 BV/h(BV:樹脂床體積)，2 BV/h，3 BV/h的體積流量進行動態(tài)吸附，定時取樣(平行測定2次，取平均值)測定流出液質(zhì)量濃度，以質(zhì)量濃度200 mg/L作為溢出點。實驗表明體積流量越慢越有利于吸附的進行，樹脂的處理量越大，但體積流量過慢需時較長，效率低。在上柱液質(zhì)量濃度1.64 mg/mL下，1 BV/h的上柱體積流量可處理的上柱液是18 BV，2 BV/h可處理16 BV，而3 BV/h只能處理11 BV，1 BV/h、2 BV/h處理的量相差不是太大，考慮到經(jīng)濟性選擇2 BV/h作為最佳上柱體積流量。見圖5。

圖5 流出液中熊果酸質(zhì)量濃度隨床體積的變化

2.6 DM130樹脂對熊果酸的解析性能

2.6.1 洗脫液質(zhì)量濃度對解析性能的影響 配制不同質(zhì)量濃度的乙醇洗脫液，先水洗已吸附達(dá)飽和的樹脂至還原糖反應(yīng)為陰性，再用15%的乙醇將雜質(zhì)洗下，然后以相同洗脫體積流量對樹脂進行動態(tài)洗脫，測定洗脫液質(zhì)量濃度(平行測定2次，取平均值)，求得累積洗脫率。實驗表明在含醇量為80% 時洗脫率已接近最大值，質(zhì)量濃度過低不利于洗脫的進行，過高則會將色素等雜質(zhì)一并洗下，影響產(chǎn)品質(zhì)量，故選擇最佳含醇量為80%。見圖6。

圖6 解析率隨含醇量的變化

2.6.2 洗脫體積流量對解析性能的影響 分別采用0.5 BV/h，1 BV/h，2 BV/h的洗脫體積流量對已吸附達(dá)飽和的樹脂進行洗脫，定量取樣測定流出液中熊果酸的質(zhì)量濃度(平行測定2次，取平均值)。結(jié)果表明，體積流量越慢洗脫效果越好，這主要是因為體積流量越慢越有利于熊果酸在樹脂和洗脫液間進行相擴散和膜擴散，從而達(dá)到溶解平衡。由圖7可見在0.5 BV/h的體積流量下，洗脫峰比較集中，3.5 BV的洗脫液就可達(dá)到洗脫完全，而其他體積流量則分別為5 BV和8 BV，因而選擇0.5 BV/h作為最佳洗脫體積流量。

圖7 洗脫液中熊果酸濃度隨床體積的變化

2.7 產(chǎn)品的制備 在最佳的吸附和解析條件下對熊果酸進行吸附和解析，解析液濃縮，真空低溫干燥后取樣測定熊果酸量。平行進行3次實驗，結(jié)果產(chǎn)品中熊果酸的量平均為46.1%。

3 結(jié)論

3.1 吸附樹脂在分離中草藥有效成分時的應(yīng)用是利用吸附的可逆性(即解吸)。由于樹脂極性、孔徑、比表面積不同，對熊果酸吸附作用力強弱不同，解吸難易也有別。由實驗從八種大孔吸附樹脂中選擇出了吸附和解析效果較好的弱極性樹脂DM130。

3.2 得到了熊果酸吸附和解析的最佳工藝條件，即:質(zhì)量濃度在1.4 ～1.8 mg/mL 范圍內(nèi)，pH 5.70，吸附流速 2 BV/h下，可處理樣品溶液16 BV。在洗脫劑含醇量80%，洗脫體積流量0.5 BV/h下，3.5 BV就可將熊果酸充分洗脫下，過柱得率達(dá)到91.3%。產(chǎn)品濃縮，低溫真空干燥，經(jīng)液相色譜檢測純度達(dá)到46.1%，而原料中僅為0.726%，由此可見采用大孔樹脂吸附法顯著富集、純化產(chǎn)品，效果良好。

［1］江蘇新醫(yī)學(xué)院編.中藥大辭典(下冊)［M］.上海:上海人民出版社，1997:2395.

［2］國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:325.

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