大孔樹脂純化野菊花總黃酮的工藝研究

程文明， 張 明， 李 俊， 戴 勝， 李 榮

(安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院安徽天然藥物活性研究省級重點實驗室，安徽合肥230032)

野菊花為菊科植物野菊(Chrysanthemum indicum L.)的頭狀花序，其性涼，味苦、辛，歸肺、肝經(jīng)，具有清熱解毒、消散癰腫、疏風(fēng)平肝之功效，在我國的藥用歷史悠久［1］。野菊花主要含倍半萜類、黃酮類及揮發(fā)油，其中黃酮類成分具有多種生理活性［2-8］。本實驗在前期研究基礎(chǔ)上［9］，選取 10 種不同廠家，不同型號的大孔樹脂，考察它們的吸附與解析性能，以總黃酮回收率為指標(biāo)，以期選出對野菊花總黃酮具有較好吸附－解吸性能的大孔樹脂，并優(yōu)化其工藝參數(shù)。

1 儀器與試劑

試劑及藥材:無水乙醇，三氯化鋁，乙酸鈉，所用試劑均為分析純;木犀草素(批號:111520-200201，中國藥品生物制品檢定所)。AB-8樹脂(分別購于天津光復(fù)精細(xì)化工研究所、西安藍(lán)曉科技有限公司)，D101樹脂、LX-60樹脂、LX-38樹脂均購自西安藍(lán)曉科技有限公司，DA201樹脂、DM301樹脂、DM130樹脂、ADS-17樹脂、HDP-100均購自安徽三星樹脂科技有限公司;野菊花藥材購于安徽亳州市藥材市場，由安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院程文明副教授鑒定為菊科植物野菊(Chrysanthemum indicum L.)的頭狀花序。

儀器:BP211D電子天平(Sartarius)，KQ-500B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，WH-2振蕩儀(江蘇省興化市分析儀器廠)，8453紫外分光光度計(Agilent)，RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(IKA)，EKS5AB電熱真空干燥箱(上海申光儀器儀表有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 野菊花提取物的制備［9］稱取野菊花干燥的藥材粗粉100 g于2000 mL圓底燒瓶中，用10倍量80%乙醇回流提取2次，每次3 h，提取液合并，抽濾，減壓濃縮，真空干燥，備用。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立［9］精密稱取木犀草素對照品2.00 mg于25 mL量瓶中，用70%乙醇溶解，定容，搖勻，制成質(zhì)量濃度為0.080 mg/mL的木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 至 25 mL 量瓶中，加入1.0 mol/L 醋酸鈉溶液 1.5 mL，0.1 mol/L三氯化鋁溶液1 mL，用蒸餾水定容，搖勻，靜置40 min，經(jīng)紫外掃描，于410 nm處測定吸光度，以總黃酮質(zhì)量濃度(mg/mL)對吸光度A進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為 C=0.0141A －0.00005(R2=0.9998)，線性范圍為 0.0016 ～0.0193 mg/mL。

2.3 樣品測定及樣品溶液的制備 精確稱取1.00 g野菊花提取物于250 mL量瓶中，用70%乙醇定容，搖勻，精確吸取溶液0.4 mL，按2.2項測定吸光度，計算野菊花提取物中總黃酮的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.2%(n=3)。定量稱取樣品，加水溶解，超聲促溶，過濾，作為上柱用樣品溶液。

2.4 不同型號吸附樹脂的篩選研究

2.4.1 靜態(tài)吸附 －解吸性能考察試驗［10］將已處理好的各種樹脂中游離水分抽干，準(zhǔn)確稱取1.00 g，置50 mL錐形瓶中，加入樣品溶液20 mL(野菊花總黃酮質(zhì)量濃度1.8 mg/mL)，每隔5 min振搖10 s，持續(xù)2 h，使其充分吸附，抽濾。精確吸取濾液0.4 mL，按2.2項測定吸光度(A)，計算總黃酮剩余量和吸附量。

將各種樹脂濾出后分別另置50 mL錐形瓶中，各加入90%乙醇20 mL，每隔5 min振搖10 s，持續(xù)2 h，使其充分解吸附，抽濾，得解吸后的濾液。分別精確量取3.0 mL解吸液，按2.2項測定并計算總黃酮的靜態(tài)比吸附量、比解吸量及解吸率。每個實驗條件，平行進(jìn)行3次實驗，結(jié)果見表1。

比吸附量=(初始質(zhì)量濃度－剩余質(zhì)量濃度)×溶液體積/干樹脂質(zhì)量

比解吸量=(解吸液質(zhì)量濃度×解吸液體積)/干樹脂質(zhì)量

解吸率(%)=比解吸量/比吸附量×100%

表1 10種大孔樹脂對總黃酮靜態(tài)吸附行為影響(n=3)Tab.1 Static adsorption of total flavonoids by ten types of macroreticuler resins(n=3)

結(jié)果顯示，靜態(tài)吸附量高且解吸率在75%左右的5種樹脂，分別是 AB-8(西安藍(lán)曉)、DM301、DM130、LX-60 及 HDP-100。

2.5 動態(tài)吸附－解吸性能考察試驗［10］稱取各種樹脂10 g分別裝入同一規(guī)格的層析柱(2.0 cm×40 cm)，加入40 mL野菊花樣品液(野菊花總黃酮質(zhì)量濃度1.8 mg/mL)，動態(tài)吸附兩次，靜置12 h，至各樹脂均達(dá)到吸附飽和，收集吸附后的樣品液，用蒸餾水將未吸附樣品液洗凈，將樣品液置于100 mL量瓶中，精確吸取溶液1 mL，按2.2項下方法操作，測定其剩余總黃酮量。

用90%乙醇洗脫，至洗脫液無色透明，將洗脫液減壓濃縮置于100 mL量瓶中，精確吸取溶液3 mL，按2.2項下方法操作，測定其中的總黃酮量，每個實驗條件，平行進(jìn)行3次實驗，結(jié)果見表2。

表2 10種大孔樹脂對總黃酮動態(tài)吸附行為的影響(n=3)Tab.2 Dynamic adsorption of total flavonoids by ten types of macroreticuler resins(n=3)

綜合樹脂靜態(tài)吸附和動態(tài)吸附試驗，可知LX-60樹脂對野菊花總黃酮顯示較高的吸附及解吸性能。

2.6 LX-60大孔樹脂純化野菊花總黃酮的工藝參數(shù)考察

2.6.1 上樣濃度對LX-60樹脂純化野菊花總黃酮的影響 精確稱取不同質(zhì)量的野菊花提取物用15%乙醇溶解，定容至50 mL。精確吸取4 mL樣品液，按2.2項下方法操作，測定其中的總黃酮量。將46 mL樣品液以2 BV/h上樣速度上柱，重復(fù)吸附一次，吸附完全后，先用蒸餾水將未吸附樣品液洗凈，再用90%乙醇洗至洗脫液中基本無黃酮。將洗脫液濃縮定容至100 mL。精確吸取4 mL解吸液，按2.2項下方法操作，測定總黃酮量，計算其轉(zhuǎn)移率，每個實驗條件，平行進(jìn)行3次實驗，結(jié)果見表3。

表3 上樣質(zhì)量濃度對總黃酮的影響(n=3)Tab.3 Effect of sample concentration on total flavonoids(n=3)

由表3可知，LX-60樹脂在低濃度時具有較高的轉(zhuǎn)移率，質(zhì)量濃度升高到1.6 mg/mL時，總黃酮轉(zhuǎn)移率開始明顯降低，故上樣質(zhì)量濃度選擇1.6 mg/mL。

2.6.2 吸附體積流量對LX-60樹脂純化野菊花總黃酮的影響 取適量野菊花提取物，溶解定容至250 mL。精確吸取4 mL樣品液，按2.2項下方法操作，測定其中的總黃酮含量。精確吸取40 mL樣品液以不同上樣速度上柱，重復(fù)吸附一次，吸附完全后，先用蒸餾水將未吸附樣品液洗凈，再用90%乙醇洗脫。將洗脫液濃縮定容至100 mL。精確吸取4 mL解吸液，按2.2項下方法操作，測定總黃酮量，計算其轉(zhuǎn)移率，每個實驗條件，平行進(jìn)行3次實驗，結(jié)果見表4。

表4 吸附體積流量對總黃酮的影響(n=3)Tab.4 Effect of adsorption rate on total flavonoids(n=3)

結(jié)果表明，吸附體積流量為1 BV/h時黃酮轉(zhuǎn)移率最高，體積流量過快吸附可能不完全。為提高工作效率，確定吸附體積流量為2 BV/h。

2.6.3 吸附次數(shù)對LX-60樹脂純化野菊花總黃酮的影響 將野菊花提取物用15%乙醇溶解定容至250 mL。精確吸取4 mL樣品液，按2.2項下方法操作，測定其中的總黃酮量。精確吸取40 mL樣品液以2 BV/h上樣體積流量上柱，以不同吸附次數(shù)，吸附完全后，先用蒸餾水將未吸附樣品液洗凈，再用90%乙醇洗脫。將洗脫液濃縮定容至100 mL。精確吸取4 mL解吸液，按2.2項下方法操作，測定總黃酮量，計算其轉(zhuǎn)移率，每個實驗條件，平行進(jìn)行3次實驗，結(jié)果見表5。

表5 吸附次數(shù)對總黃酮的影響(n=3)Tab.5 Effect of adsorption times on total flavonoids(n=3)

由表5可以看出，吸附2次時野菊花總黃酮的轉(zhuǎn)移率較高。

2.6.4 吸附時間對LX-60樹脂純化野菊花總黃酮的影響 將野菊花提取物用15%乙醇溶解定容至250 mL。精確吸取4 mL樣品液，按2.2項下方法操作，測定其中的總黃酮量。精確吸取40 mL樣品液以2 BV/h上樣體積流量上柱，重復(fù)吸附一次，分別靜置吸附0.5、1、2、4 h 后，先用蒸餾水將未吸附樣品液洗凈，再用90%乙醇洗脫。將洗脫液濃縮定容至100 mL。精確吸取4 mL解吸液，按2.2項下方法操作，測定總黃酮量，計算其轉(zhuǎn)移率，每個實驗條件，平行進(jìn)行3次實驗，結(jié)果見表6。

表6 吸附時間對總黃酮的影響(n=3)Tab.6 Effect of adsorption time on total flavonoids(n=3)

由表6可知，較長吸附時間并未提高總黃酮的轉(zhuǎn)移率，故靜置0.5 h即可。

2.6.5 洗脫劑濃度對LX-60樹脂純化野菊花總黃酮的影響 取適量野菊花提取物，溶解定容至250 mL。精確吸取4 mL樣品液，按2.2項下方法操作，測定其中的總黃酮量。精確吸取40 mL樣品液以2 BV/h上樣體積流量上柱，重復(fù)吸附一次，吸附完全后，先用蒸餾水將未吸附樣品液洗凈，再分別用不同濃度的乙醇洗脫至洗脫液中基本無黃酮。將洗脫液濃縮定容至100 mL。精確吸取4 mL解吸液，按2.2項下方法操作，測定總黃酮量，計算其轉(zhuǎn)移率，每個實驗條件，平行進(jìn)行3次實驗，結(jié)果見表7。

表7 洗脫劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)對總黃酮的影響(n=3)Tab.7 Effect of concentration of eluent on total flavonoids(n=3)

由表7可知，在較高洗脫劑濃度下，野菊花總黃酮有較高的轉(zhuǎn)移率，故選取90%乙醇為最佳洗脫劑濃度。

2.6.6 沖洗用水體積對LX-60樹脂純化野菊花總黃酮的影響 取適量野菊花提取物，溶解定容至250 mL。精確吸取4 mL樣品液，按2.2項下方法操作，測定其中的總黃酮量。精確吸取40 mL樣品液以2 BV/h上樣體積流量上柱，重復(fù)吸附一次，吸附完全后，用不同體積的蒸餾水將未吸附樣品液洗凈，再用90%乙醇洗脫。將洗脫液濃縮定容至100 mL。精確吸取4 mL解吸液，按2.2項下方法操作，測定總黃酮量，計算其轉(zhuǎn)移率，每個實驗條件，平行進(jìn)行3次實驗，結(jié)果見表8。

表8 沖洗用水體積對總黃酮的影響(n=3)Tab.8 Effect of volume of washing water on total flavonoids(n=3)

由表8可知，用蒸餾水4 BV沖洗樹脂，能夠達(dá)到較高的轉(zhuǎn)移率。

2.6.7 洗脫速度對LX-60樹脂純化野菊花總黃酮的影響 取適量野菊花提取物，溶解定容至250 mL。精確吸取4 mL樣品液，按2.2項下方法操作，測定其中的總黃酮量。精確吸取40 mL樣品液以2 BV/h上樣體積流量上柱，重復(fù)吸附一次，吸附完全后，先用蒸餾水將未吸附樣品液洗凈，再分別用90%的乙醇以不同的洗脫速度洗脫。將洗脫液濃縮定容至100 mL。精確吸取4 mL解吸液，按2.2項下方法操作，測定總黃酮含量，計算其轉(zhuǎn)移率，每個實驗條件，平行進(jìn)行3次實驗，結(jié)果見表9。

表9 洗脫體積流量對總黃酮的影響(n=3)Tab.9 Effect of eluting rate on total flavonoids(n=3)

由表9可知，洗脫速度較慢時能將總黃酮轉(zhuǎn)移較完全，因此，選取2 BV/h為最佳洗脫體積流量。

2.6.8 洗脫劑體積對LX-60樹脂純化野菊花總黃酮的影響 取適量野菊花提取物，溶解定容至250 mL。精確吸取4 mL樣品液，按2.2項下方法操作，測定其中的總黃酮含量。精確吸取40 mL樣品液以2 BV/h上樣體積流量上柱，重復(fù)吸附一次，吸附完全后，用蒸餾水將未吸附樣品液洗凈，再用不同體積的90%乙醇洗脫。將洗脫液濃縮定容至100 mL。精確吸取4 mL解吸液，按2.2項下方法操作，測定總黃酮量，計算其轉(zhuǎn)移率，每個實驗條件，平行進(jìn)行3次實驗，結(jié)果見表10。

表10 洗脫劑體積對總黃酮的影響(n=3)Tab.10 Effect of volume of eluent on total flavonoids(n=3)

由表10可知，4 BV洗脫劑就可以將總黃酮較完全地被洗脫下來。

2.6.9 樹脂柱徑高比對LX-60樹脂純化野菊花總黃酮的影響 取適量野菊花提取物，溶解定容至250 mL。精確吸取4 mL樣品液，按2.2項下方法操作，測定其中的總黃酮含量。精確吸取50 mL樣品液以2 BV/h上樣體積流量上于不同徑高比(1∶2;1∶6;1∶20)的層析柱，重復(fù)吸附一次，吸附完全后，用蒸餾水將未吸附樣品液洗凈，再用不同體積的90%乙醇洗脫。將洗脫液濃縮定容至100 mL。精確吸取4 mL解吸液，按2.2項下方法操作，測定總黃酮量，計算其轉(zhuǎn)移率，每個實驗條件，平行進(jìn)行3次實驗，結(jié)果見表11。

表11 徑高比對總黃酮影響(n=3)Tab.11 Effect of diameter height ratio of column on total flavonoids(n=3)

由表11可知，樹脂柱過短使得總黃酮轉(zhuǎn)移率偏低，徑高比達(dá)1∶6時，黃酮轉(zhuǎn)移率較高。

2.6.10 樹脂重復(fù)使用次數(shù)對LX-60樹脂純化野菊花總黃酮的影響 取適量野菊花提取物，溶解定容至250 mL。精確吸取4 mL樣品液，按2.2項下方法操作，測定其中的總黃酮量。精確吸取40 mL樣品液以2 BV/h上柱，重復(fù)吸附一次，吸附完全后，用蒸餾水將未吸附樣品液洗凈，再用不同體積的90%乙醇洗脫。按將洗脫液濃縮定容至100 mL。按此方法重復(fù)5次。精確吸取4 mL解吸液，按2.2項下方法操作，測定總黃酮量，計算其轉(zhuǎn)移率，每個實驗條件，平行進(jìn)行3次實驗，結(jié)果見表12。

表12 樹脂重復(fù)使用次數(shù)對總黃酮的影響(n=3)Tab.12 Effect of resin repeated adsorptions on total flavonoids(n=3)

由表12可知，重復(fù)使用次數(shù)增加到5次時，黃酮轉(zhuǎn)移率明顯降低，故LX-60樹脂純化野菊花總黃酮可重復(fù)使用4次。

2.6.11 泄漏曲線的繪制 將質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL的樣品液加入已預(yù)處理好的LX-60樹脂(10 g)，進(jìn)行動態(tài)吸附。控制體積流量為2 BV/h，每10 mL為一流分。當(dāng)樹脂不再吸附總黃酮時，停止上樣，記錄上樣量，精確吸取2 mL解吸液，按2.2項下方法操作，測定各流分中野菊花總黃酮A值，繪制泄漏曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 總黃酮泄漏曲線Fig.1 Leakage curve of total flavonoids

由泄漏曲線可以看出，在上樣體積達(dá)到240 mL時，黃酮已經(jīng)出現(xiàn)明顯泄漏。因此，樹脂對黃酮最大上樣量為48 mg/g干樹脂。

2.6.12 洗脫曲線的繪制 取適量野菊花提取物，溶解定容至250 mL。精確吸取40 mL樣品液以2 BV/h上樹脂柱(1BV=10 mL)，重復(fù)吸附一次，吸附完全后，用蒸餾水將未吸附樣品液洗凈，再用90%乙醇洗脫，每10 mL為一流分，至洗脫液基本無黃酮時停止。精確吸取4 mL解吸液，按2.2項下方法操作，測定各流份中總黃酮A值，繪制洗脫曲線，結(jié)果見圖2。

圖2 總黃酮洗脫曲線Fig.2 Elution curve of total flavonoids

由洗脫曲線可以看出，在洗脫至40 mL(4 BV)洗脫劑時，黃酮含量已經(jīng)很低，表明此時洗脫已經(jīng)較完全。

2.7 驗證試驗 取適量野菊花提取物，溶解定容至250 mL。精確吸取4 mL樣品液，按2.2項下方法操作，測定其中的總黃酮量。精確吸取40 mL樣品液，以2 BV/h加入LX-60大孔樹脂(10 g)中，重復(fù)吸附一次，吸附完全后，用蒸餾水將未吸附樣品液洗凈，再用90%乙醇洗脫完全。將洗脫液濃縮并定容至100 mL。精確吸取4 mL解吸液，按2.2項下方法操作，測定并計算總黃酮轉(zhuǎn)移率及純度，每個實驗條件，平行進(jìn)行3次實驗，結(jié)果表明，LX-60樹脂對野菊花總黃酮的轉(zhuǎn)移率可達(dá)到92.3%(n=3)，總黃酮純度為34.3%(n=3)，比提取物提高了6.6倍，說明LX-60樹脂對野菊花總黃酮具有良好的純化作用。

3 討論

3.1 據(jù)報道，部分結(jié)構(gòu)黃酮在NaOH中穩(wěn)定性差，故本實驗采用NaAc-AlCl3體系測定野菊花總黃酮的量［11-12］。本實驗采用木犀草素為對照品，以NaAc-AlCl3顯色，通過紫外掃描，發(fā)現(xiàn)在410 nm處有最大吸收，此處雜質(zhì)無干擾，對照品及樣品在顯色后40 min內(nèi)穩(wěn)定。

3.2 本實驗所選大孔樹脂有非極性(D101，LX-60，HDP-100)，弱、中極性(AB-8，LX-38，DM130;ADS-17，DM301)、極性(DA201)之分。通過對10種樹脂的靜態(tài)及動態(tài)吸附－解吸性能比較，結(jié)果表明LX-60型大孔吸附樹脂用于富集野菊花總黃酮，不僅吸附容量較大，洗脫率較高，而且樹脂性能穩(wěn)定，可重復(fù)使用。LX-60樹脂純化野菊花總黃酮的優(yōu)化工藝為:層析柱徑高比為1∶6，上樣質(zhì)量濃度1.6 mg/mL，吸附速度2 BV/h，最大上樣量48 mg/g干樹脂，重復(fù)吸附2次，沖洗用蒸餾水用量4 BV，洗脫劑為90%乙醇，解吸速度2 BV/h，洗脫劑用量4 BV。通過驗證試驗表明，此方法對野菊花總黃酮具有良好的純化作用。

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