兩種常用膜對(duì)地龍勻漿液有效成分分級(jí)分離效果的比較

戴啟剛， 詹秀琴

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京210046;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京210046)

現(xiàn)代膜分離技術(shù)(membrane separation technology，MST)以選擇性透過(guò)膜為分離介質(zhì)，以膜孔徑大小為特征，在推動(dòng)力(如壓力差、濃度差、電位差等)驅(qū)使下，原料側(cè)組分選擇性地通過(guò)膜，以達(dá)到分離、提純的目的［1］，其產(chǎn)物或是單一成分，或是某一分子量區(qū)段的多種成分，能有效地分離提純同一活性組分群。因其具有節(jié)能、高效、無(wú)相變化、操作方便、無(wú)二次污染、操作溫度低等優(yōu)點(diǎn)，在中藥尤其是主要活性成分為熱敏性蛋白的動(dòng)物藥的分離純化中有廣泛的應(yīng)用前景。MST所用膜有多種材質(zhì)，在中藥有效成分分離中常用膜材料主要是無(wú)機(jī)膜、高分子有機(jī)膜(如聚偏氟乙烯 polyvinylidenefluoride，PVDF)［2］。其中PVDF是一種新興的、綜合性能優(yōu)良的膜材料，機(jī)械強(qiáng)度高，耐酸堿等苛刻環(huán)境條件和化學(xué)穩(wěn)定性好，是超濾和微濾的常用膜材料;而無(wú)機(jī)陶瓷膜具有優(yōu)異的化學(xué)穩(wěn)定性和良好的機(jī)械強(qiáng)度，在中藥體系的應(yīng)用中突出優(yōu)點(diǎn)在于其抗污染性能強(qiáng)，對(duì)藥液的前處理要求不高，膜可以反復(fù)再生，操作過(guò)程穩(wěn)定，常用的是三氧化二鋁(Al2O3)和氧化鋯(ZrO2)膜管。

現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)［3］，動(dòng)物藥地龍(Pheretima)活性成分多元化，具有抗凝、溶栓、抑制血小板聚集、抗癌、平喘、抗氧化等活性作用。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)動(dòng)物類中藥地龍的主要有效成分為蛋白多肽類物質(zhì)，如蚯蚓纖溶酶、蚓激酶等，分子量多在10000～100000之間，且其分子量分布與藥效作用有密切相關(guān)性的基本原理，選擇PVDF、無(wú)機(jī)Al2O3及ZrO2陶瓷膜管對(duì)地龍勻漿液有效組分進(jìn)行分級(jí)分離提純，精制出多個(gè)具有不同分子量分布特征的地龍活性組分群，根據(jù)所測(cè)各分離液中活性組分的蛋白含量、分子量分布、纖溶活性，比較兩種膜分離提純地龍勻漿液有效組分的優(yōu)劣，為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)分離提純地龍勻漿液有效組分提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)材料和設(shè)備

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 鮮地龍:品種為赤子愛(ài)勝蚓(Eisenia foetide)，購(gòu)于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)養(yǎng)殖場(chǎng);考馬斯亮藍(lán)G-250、R-250(美國(guó) AMRESCO公司生產(chǎn)，進(jìn)口分裝);牛血清白蛋白(BSA)、低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(為6種蛋白質(zhì)的混合體，分別為卵清溶菌酶14400、胰蛋白酶抑制劑20100、牛碳酸酐酶31000、兔肌動(dòng)蛋白酶43000、牛血清清蛋白66200、兔磷酸化酶97400)(上海伯奧生物科技有限公司產(chǎn)品);牛纖維蛋白原、凝血酶原、纖溶酶原、尿激酶均購(gòu)于江蘇省藥品生物制品檢驗(yàn)所;瓊脂糖(BDH進(jìn)口分裝);其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或者Sigma分析純。

聚偏氟乙烯膜(PVDF):截留分子量(MWCO)為 10000、50000、100000，購(gòu)于上海應(yīng)用物理研究所;膜管:0.2 μm Al2O3、50 nm ZrO2無(wú)機(jī)陶瓷膜管，均購(gòu)于南京工業(yè)大學(xué)膜科學(xué)技術(shù)研究所，所有膜管外徑12 mm，內(nèi)徑8 mm，長(zhǎng)20 cm，有效濾過(guò)面積為0.005 m2。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備 XHF-1內(nèi)切式勻漿器，購(gòu)于浙江寧波新芝科學(xué)儀器研究所;臺(tái)式高速冷凍離心機(jī):TGL-16M型，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司生產(chǎn);DYY-Ⅲ713型電泳槽、DYY-4型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、WD-9405B型脫色搖床，均購(gòu)自北京六一儀器廠;37℃恒溫水浴箱;打孔器;玻璃平板(9 cm×9 cm);721分光光度計(jì)，上海分析儀器廠生產(chǎn);37度恒溫水浴鍋;臺(tái)式離心機(jī);微量式移液槍。

SCM超濾杯:膜有效過(guò)濾面積為3.32×10－3m2，購(gòu)于上海應(yīng)用物理研究所新技術(shù)中心;微型無(wú)機(jī)陶瓷微濾膜裝置，南京化工大學(xué)膜科學(xué)技術(shù)研究所研制。實(shí)驗(yàn)裝置如圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)裝置流程圖Fig.1 Experimental process diagram

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 過(guò)膜操作 取一定量的地龍，加入3倍量的二次蒸餾水，勻漿10 min，11000 r/min ×20 min、10 ℃離心，取地龍上清液置于4℃冰箱冷藏備用。

SCM超濾杯過(guò)膜分離過(guò)程:取100 mL地龍上清液，在最優(yōu)操作條件下即 0.25 MPa，30 °C，200 r/min，pH 為 6.7，地龍濃度為 33.3%(w:w)(本課題組已發(fā)表相關(guān)論文［4］)依次過(guò)膜材料孔徑(MWCO)為100000、50000、10000超濾膜進(jìn)行分級(jí)過(guò)濾。即上清液先用MWCO 100000超濾膜進(jìn)行過(guò)濾，當(dāng)濾過(guò)液為80 mL時(shí)，往杯內(nèi)截留液中加入10 mL雙蒸水，繼續(xù)超濾，至濾過(guò)液體積為約100 mL時(shí)停止。截留液保留備用，100 mL濾過(guò)液在清洗超濾杯后用MWCO 50000超濾膜進(jìn)行過(guò)膜分離。依法分離，收集每一級(jí)濾過(guò)液和截留液，備用。

無(wú)機(jī)陶瓷微濾膜膜分離過(guò)程:取一定量地龍上清液，在0.15 MPa，50 ℃，33.3%的最佳操作條件下(本課題組已發(fā)表相關(guān)論文［5］)先后用 0.2 μm Al2O3、50 nm ZrO2無(wú)機(jī)陶瓷膜管對(duì)地龍勻漿液進(jìn)行分級(jí)分離，方法如PVDF膜分離，收集每一級(jí)的濾過(guò)液和截留液，備用。

2.2 蛋白濃度的測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)結(jié)合法測(cè)定各級(jí)濾過(guò)液和截留液蛋白質(zhì)的量。按照文獻(xiàn)［6］方法，以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，用0.15 mol/L NaCl將其做梯度稀釋成 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL 液，加入考馬斯亮藍(lán)G-250，在595 nm處讀取吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣品的吸光值與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，即可計(jì)算出樣品的蛋白濃度。

2.3 分子量分布測(cè)定 采用十二烷基磺酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測(cè)定樣品中活性蛋白的分子量范圍和量大小。按照文獻(xiàn)［7］方法，采用5%濃縮膠、12%分離膠。

2.4 纖溶活性檢測(cè) 按Astrup法［8］制備纖維蛋白平板:將平板(9 cm×9 cm)放在水平儀上調(diào)至水平，用1倍pH7.2 PBS溶液配制1%的瓊脂糖，取5 mL 65℃恒溫，另取等體積緩沖液5 mL，在37℃恒溫箱中保溫，加入1/4支纖維蛋白原和10U凝血酶，終質(zhì)量濃度為3 mg/mL，兩種溶液迅速混勻，趁熱倒入平板中，將氣泡趕至邊緣，室溫下凝固，用外徑6 mm的打孔器打孔(數(shù)目按需要定)。分別在孔中加入20 μL不同濃度的尿激酶、待測(cè)樣品，37℃恒溫水浴5 h后測(cè)溶圈兩相互垂直的直徑。重復(fù)3次。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論

3.1 蛋白濃度的測(cè)定

3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 據(jù)表1的數(shù)據(jù)以標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度為橫坐標(biāo)、OD595nm值為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 標(biāo)準(zhǔn)蛋白牛血清白蛋白OD595 nm值Tab.1 OD595 nmof standard protein BSA

分析標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，蛋白量與光密度成線性關(guān)系，OD595nm值=0.56×標(biāo)準(zhǔn)蛋白BSA濃度，可根據(jù)光密度計(jì)算出樣品的蛋白量。

3.1.2 各樣品中的蛋白量及討論 根據(jù)光密度值，測(cè)定膜分級(jí)過(guò)濾所得濾液蛋白量變化如表2及蛋白濃度見(jiàn)表3。

表2 過(guò)膜前后蛋白量變化Tab.2 Change of protein level after membrane separation

表3 樣品液蛋白質(zhì)量濃度(mg/mL)Tab.3 Concentration of protein in sample solution(mg/mL)

由表2、3可見(jiàn)，PVDF10萬(wàn)膜截留前后液中蛋白濃度相差不大，且膜蛋白截留率較小，能將大分子蛋白截留，允許小分子蛋白通過(guò)，因此有利于后面的分級(jí)分離;5萬(wàn)膜二級(jí)分離時(shí)截留液中蛋白量遠(yuǎn)高于濾過(guò)液，截留率高，說(shuō)明其截留效果最好，能制備高濃度的地龍蛋白液，但同時(shí)又會(huì)因蛋白吸附在膜表面形成濾餅層及膜孔阻塞造成膜污染嚴(yán)重，把分子量小于50000的蛋白質(zhì)也截留了下來(lái);1萬(wàn)膜的截留率小，這是因?yàn)槿?jí)分離時(shí)，液體中的蛋白質(zhì)量已減少，且大多數(shù)是分子量較小的蛋白和多肽，蛋白質(zhì)通過(guò)率高，但對(duì)分子量10000的蛋白質(zhì)能有效截留純化。

圖2 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳Fig.2 SDS-PAGE of Samples

無(wú)機(jī)陶瓷膜用0.2 μm Al2O3管分離時(shí)，截留液和濾過(guò)液中的蛋白含量相差很大，膜的截留率為49.3%，且蛋白丟失率達(dá)48.7%。無(wú)機(jī)膜二級(jí)分離用50 nm ZrO2膜管，截留液和濾過(guò)液中的蛋白量存在差別，且膜的截留率高、蛋白丟失率小，這說(shuō)明經(jīng)一級(jí)Al2O3膜管處理后的液體再用ZrO2膜管，能將活性蛋白截留濃縮，另外該級(jí)膜分離時(shí)蛋白質(zhì)丟失少。

3.2 分子量分布測(cè)定 圖2A中可見(jiàn)10萬(wàn)膜截留液中對(duì)應(yīng)位置在26000以上的蛋白條帶和勻漿液幾乎一致但條帶淺，說(shuō)明它能允許較多的小分子蛋白通過(guò)膜。而5萬(wàn)膜截留液中蛋白量大且種類多，能將較多蛋白截留濃縮。1萬(wàn)膜截留液中分子量在31000以下有一條帶，說(shuō)明其對(duì)這一分子量的蛋白質(zhì)能有效截留。

圖2B中發(fā)現(xiàn)，地龍勻漿液主要活性蛋白分子量分布在 10000 ～100000。勻漿液、0.2 μm Al2O3截留液的蛋白條帶所處位置幾乎一致，但后者蛋白條帶染色深，蛋白量大，這說(shuō)明0.2 μm Al2O3管能將勻漿液中的蛋白有效截留濃縮，分子量在26000左右的含量尤其高，26000以下分子量的蛋白比較少，說(shuō)明其截留的主要是分子量不小于26000的蛋白質(zhì)。50 nm ZrO2濾過(guò)液中分子量在20100以下的蛋白量較高。這說(shuō)明用無(wú)機(jī)膜分離地龍勻漿液精制活性成分，一級(jí)0.2 μm Al2O3膜管純化效果差，但用二級(jí)膜管分離可以得到某一分子量范圍的活性組分群。

3.3 纖溶活性測(cè)定

3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定 用20 μL濃度分別為20、40、60、80、100 U/mL 的尿激酶點(diǎn)樣，測(cè)定溶圈的兩個(gè)互相垂直的直徑，兩直徑乘積減去孔直徑(6 mm)平方即為溶圈面積，以尿激酶濃度為橫坐標(biāo)、溶圈面積為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 尿激酶纖溶活性測(cè)定Tab.4 Determination of fibrinolytic activity of urokinase

分析標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，溶圈面積=－35.56+1.75×尿激酶濃度。表明當(dāng)尿激酶濃度大于20 U/mL時(shí)，溶圈面積和尿激酶的濃度成線性關(guān)系。本方法靈敏可靠，可以通過(guò)比較溶圈面積的大小來(lái)判定纖溶作用的強(qiáng)弱。

3.3.2 分級(jí)分離樣品的纖溶活性測(cè)定 分別將膜分離的樣品點(diǎn)樣在纖維蛋白平板孔中，測(cè)定溶圈的兩個(gè)互相垂直的直徑，并計(jì)算兩者的乘積，兩者的乘積減去孔直徑平方即為溶圈的面積，可用來(lái)反映樣品的纖溶活性。結(jié)果見(jiàn)圖3、表5。

從表中可以看出，PVDF 5萬(wàn)膜截留液的蛋白量最多，溶圈面積最大，說(shuō)明5萬(wàn)膜基本上能將有纖溶活性的蛋白質(zhì)截留濃縮，有利于對(duì)地龍勻漿液有效成分的分離;10萬(wàn)膜分離時(shí)，截留液和濾過(guò)液蛋白量、溶圈面積差別不大;而用無(wú)機(jī)陶瓷膜0.2 μm Al2O3分離，則蛋白量低，溶圈面積小，纖溶活性小。至于PVDF 1萬(wàn)膜和50 nm ZrO2二級(jí)無(wú)機(jī)膜濾過(guò)剛截留液和濾過(guò)液同樣存在著蛋白量低，溶圈面積小，纖溶活性低，不利于得到高濃度高纖溶活性的蛋白截留提純物。

圖3 膜分離物的纖溶活性Fig.3 Fibrinolytic activity determination of products of membrane separation

表5 分離物的纖溶活性測(cè)定Tab.5 Fibrinolytic activity determination of products of membrane separation

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)地龍分級(jí)分離物的蛋白含量測(cè)定、分子量分布測(cè)定、纖溶活性測(cè)定，結(jié)果顯示:有機(jī)膜PVDF對(duì)地龍勻漿液的分離純化效果較好，MWCO 50，000膜分離能得到具有較大纖溶活性蛋白組分群;無(wú)機(jī)0.2 μm Al2O3陶瓷膜不適合分離蛋白量較多的地龍勻漿液，但50 nm ZrO2能對(duì)經(jīng)過(guò)0.2 μm Al2O3處理的濾過(guò)液進(jìn)行一定程度的有效分離純化。因此，PVDF可用來(lái)對(duì)地龍勻漿液分離純化，其效果好于無(wú)機(jī)陶瓷膜。

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