雙黃連注射液HPLC指紋圖譜研究

王艷偉， 宋立言， 代雪平， 宋漢敏

(1.河南省食品藥品檢驗(yàn)所，河南鄭州450003;2.鄭州大學(xué)臨床藥理研究所，河南 鄭州450052)

雙黃連注射液是由金銀花、黃芩、連翹制成的現(xiàn)代中藥制劑，具有清熱解毒、清宣風(fēng)熱的作用。臨床上用于外感風(fēng)熱引起的發(fā)熱、咳嗽、咽痛。適用于病毒及細(xì)菌感染的上呼吸道感染、肺炎、扁桃體炎、咽炎等［1］。但隨著使用范圍日漸擴(kuò)大，應(yīng)用人群增加，加之臨床應(yīng)用不當(dāng)及生產(chǎn)工藝不穩(wěn)定多方面因素，引起的不良反應(yīng)例數(shù)也相應(yīng)增加，甚至有致人死亡的個案［2-3］。為進(jìn)一步規(guī)范雙黃連注射液的生產(chǎn)，提高其質(zhì)量，減少不良反應(yīng)的發(fā)生，根據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理局《中藥注射劑安全性再評價基本技術(shù)要求》，本實(shí)驗(yàn)建立了雙黃連注射液的HPLC指紋圖譜，為雙黃連注射液的全面質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters Alliance 2695系統(tǒng)，含四元梯度泵、在線脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣器、柱溫箱以及Waters Empower色譜工作站，Waters二極管陣列檢測器(PDA 996);Phenomenex Luna C18(2)100A(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱。

1.2 試劑與樣品 綠原酸對照品(批號110753-200413，中國藥品生物制品檢定所)，咖啡酸對照品(批號110885-200102，中國藥品生物制品檢定所)，黃芩苷對照品(批號110715-200514，中國藥品生物制品檢定所)，黃芩素對照品(批號111595-200604，中國藥品生物制品檢定所);甲醇、乙腈為色譜純(Merck公司)，磷酸為分析純(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)，水為超純水;黃芩、金銀花、連翹藥材由河南福森藥業(yè)有限公司提供，并經(jīng)河南省食品藥品檢驗(yàn)所雷留成副主任藥師鑒定;注射用黃芩提取物、注射用金銀花連翹提取物由河南福森藥業(yè)有限公司提供;雙黃連注射液由河南福森藥業(yè)有限公司提供(批號:0910001，0910002，0910003，0910004，0910005，0910006，0910009，0910010，0910011，0910012，0910016，0910018，0910019，0910020)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 雙黃連注射液:Phenomenex Luna C18(2)100A 色譜柱:(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相為乙腈(A)－0.5%磷酸溶液(B)進(jìn)行梯度洗脫，0 ～5 min，5%A ～5%A，5 ～15 min，5%A ～10%A，15 ～20 min，10%A ～14%A，20 ～50 min，14%A～18%A，50 ～70 min，18%A ～25%A，70 ～85 min，25%A ～30%A，85 ～110 min，30%A ～50%A，體積流量1 mL/min;檢測波長350 nm;柱溫40℃。理論板數(shù)按綠原酸峰計(jì)算應(yīng)不低于6000。

黃芩藥材、注射用黃芩提取物、金銀花藥材、注射用金銀花連翹提取物色譜條件同上，連翹藥材檢測波長為280 nm，其余條件同上。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取綠原酸對照品適量，置棕色量瓶中，加50%甲醇制成每1 mL含60 μg的溶液，即得(10℃以下保存)。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 黃芩 取本品粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流2 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.2 注射用黃芩提取物 取本品約50 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，加水20 mL，超聲處理10 min，振搖并滴加0.1 mol/L氫氧化鈉溶液使完全溶解(pH值不大于7.0)，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 金銀花 取本品粉末約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流2 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 連翹 取本品粉末約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流4 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.5 注射用金銀花連翹提取物 精密吸取本品2 mL，置100 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.6 雙黃連注射液 取本品，搖勻，濾過，作為供試品溶液。

2.4 樣品測定 精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄110 min色譜圖。將色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)，與對照指紋圖譜相比較，計(jì)算相似度。

3 方法學(xué)考察

3.1 精密度試驗(yàn) 取同一批次供試品溶液(批號:0910001)，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定指紋圖譜。結(jié)果表明，各色譜峰相對保留時間的RSD均在0.2%以內(nèi)，相對峰面積的RSD均在5%以內(nèi)，有較高的相似度(均在0.95以上)，精密度良好。

3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批次供試品溶液(批號:0910001)，分別在第 0、2、4、6、8、10 h 進(jìn)樣，測定指紋圖譜。結(jié)果表明，各色譜峰相對保留時間的RSD均在0.2%以內(nèi)，相對峰面積的RSD均在5%以內(nèi)，有較高的相似度(均在0.95以上)，供試品溶液在10 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次樣品(批號:0910001)，平行制備6份供試品溶液，測定指紋圖譜。結(jié)果表明，各色譜峰相對保留時間的RSD均在0.2%以內(nèi)，相對峰面積的RSD均在5%以內(nèi)，有較高的相似度(均在0.95以上)，重復(fù)性良好。

4 雙黃連注射液指紋圖譜的建立

測定本品14批樣品的指紋圖譜，將其結(jié)果導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004，1.0A版)，以平均數(shù)法生成對照圖譜，評價各樣品的相似度，結(jié)果見圖1、表1(屏蔽12號黃芩苷峰)。確定特征峰14個，統(tǒng)計(jì)了各批總出峰數(shù)，特征峰數(shù)與總出峰數(shù)的百分比及特征峰與總出峰面積的百分比。見表2。

5 雙黃連注射液對照指紋圖譜中色譜峰的確認(rèn)

取大黃酚、大黃素甲醚、咖啡酸、綠原酸、連翹苷、黃芩苷、蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷、木犀草苷、木犀草素、槲皮素、黃芩素、漢黃芩素、漢黃芩苷、隱綠原酸、新綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、連翹酯苷A等對照品，分別配制成適當(dāng)質(zhì)量濃度的對照品，按照指紋圖譜測定方法，測定對照品色譜圖，并與對照指紋圖譜中的相關(guān)峰進(jìn)行光譜圖比對，最后確認(rèn)對照指紋圖譜中1號峰為新綠原酸，2號峰為綠原酸，3號峰為隱綠原酸，4號峰為咖啡酸，7號峰為連翹酯苷A，9號峰為異綠原酸B，10號峰為異綠原酸A，11號峰為異綠原酸C，12號峰為黃芩苷，14 號峰為黃芩素［4］。

表1 14批雙黃連注射液指紋圖譜相似度結(jié)果Tab.1 The results of the 14 batches of Shuanghuanglian Injection Similarity analysis

圖1 雙黃連注射液對照指紋圖譜Fig.1 The HPLC fingerprint of Shuanghuanglian Injection

表2 14批雙黃連注射液的總出峰數(shù)及其特征峰所占比例Tab.2 The total numbers of the peaks of Shuanghuanglian Injection and its proportion of the characteristic peaks

6 雙黃連注射液對照指紋圖譜中特征峰的歸屬

取黃芩、黃芩提取物、金銀花、連翹、金銀花連翹提取物制成適當(dāng)濃度的供試品溶液，按照指紋圖譜測定方法，測定各自色譜圖，并與對照指紋圖譜中的相關(guān)峰進(jìn)行光譜圖比對，最后確認(rèn)對照指紋圖譜中1號峰為新綠原酸，2號峰為綠原酸，3號峰為隱綠原酸，9號峰為異綠原酸B、10號峰為異綠原酸A、11號峰為異綠原酸C，上述峰均來自金銀花;4號峰為咖啡酸，來自金銀花和連翹;7號峰為連翹酯苷A，與5、6號峰均來自連翹;12號峰為黃芩苷，14號峰為黃芩素，與8號、13號峰均來自黃芩［5］(圖2～圖6)。

圖2 注射用金銀花連翹提取物指紋圖譜Fig.2 The HPLC fingerprint of extract of Loniceral japonicae Flos and Forsythiae Fructus

7 討論

7.1 洗脫系統(tǒng)的選擇 試驗(yàn)過程中共選擇了甲醇－0.5% 冰醋酸溶液［6］、乙腈 － 0.5% 冰醋酸溶液［7］、乙腈 －0.5%磷酸溶液等3種流動相系統(tǒng)，結(jié)果表明乙腈－0.5%磷酸溶液分離效果最好。

圖3 連翹指紋圖譜Fig.3 The HPLC fingerprint of Forsythiae Fructus

圖4 金銀花指紋圖譜Fig.4 The HPLC fingerprint of Lonicerae japonicae Flos

圖5 黃芩指紋圖譜Fig.5 The HPLC fingerprint of Scutellariae Radix

圖6 注射用黃芩提取物指紋圖譜Fig.6 The HPLC fingerprint of Scutellariae Radix extract

7.2 檢測波長的選擇 試驗(yàn)過程中，波長為254 nm和280 nm下，黃芩苷峰過大，其他峰相對峰面積不穩(wěn)定，不易分開，波長350 nm下各峰比例良好，峰與峰間距良好，易于分辨，故選擇350 nm為測定波長。

7.3 柱溫的選擇 為了保持色譜分析的一致性，設(shè)定柱溫來控制不同實(shí)驗(yàn)環(huán)境下的色譜分析，試驗(yàn)中考察了25℃、30℃、35℃、40℃柱溫下的分離情況，結(jié)果表明，柱溫40℃時分離效果較好。

7.4 實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)雙黃連注射液指紋圖譜與注射用金銀花連翹提取物指紋圖譜存在一定差異，原因可能是雙黃連注射液制備工藝中用40%氫氧化鈉溶液調(diào)pH值，在加熱滅菌及放置過程中使綠原酸同系物及連翹酯苷同系物發(fā)生了水解反應(yīng)所致，具體反應(yīng)機(jī)理尚需進(jìn)一步研究。

7.5 實(shí)驗(yàn)中確定了14個特征色譜峰，較為全面的反映了雙黃連注射液藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，為加強(qiáng)雙黃連注射液質(zhì)量控制提供了依據(jù)。但雙黃連注射液有效成分復(fù)雜［8-12］，尚需進(jìn)一步研究其藥理、毒理的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)理，確定雙黃連注射液臨床療效和不良反應(yīng)產(chǎn)生的根源，為臨床合理用藥提供科學(xué)依據(jù)。

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