蛋白酶產(chǎn)生菌LN02發(fā)酵玉米黃粉蛋白的條件優(yōu)化

韓秋菊，張倩倩

(遼寧石油化工大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院，遼寧 撫順 113001)

玉米黃粉蛋白是玉米淀粉生產(chǎn)的主要副產(chǎn)物，是由玉米籽粒經(jīng)濕磨法工藝制得的粗淀粉乳經(jīng)淀粉分離機(jī)分出的蛋白質(zhì)水(即麩質(zhì)水)，經(jīng)濃縮離心機(jī)或沉淀池濃縮后，再經(jīng)脫水干燥制成，俗稱黃粉子。玉米黃粉蛋白含有豐富的蛋白質(zhì)，尤其是中性氨基酸和芳香族氨基酸含量較高，但由于醇溶性蛋白多，疏水性強(qiáng)，很難直接應(yīng)用[1～3]。為了提高其利用率，必須先對(duì)其進(jìn)行修飾水解。作者利用一株蛋白酶產(chǎn)生菌LN02對(duì)玉米黃粉蛋白進(jìn)行水解發(fā)酵，初步優(yōu)化了發(fā)酵條件，為玉米黃粉蛋白的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了一條新的途徑。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌株與培養(yǎng)基

蛋白酶產(chǎn)生菌LN02，自行提供。

種子培養(yǎng)基(LB)：蛋白胨1.0%，酵母粉0.5%，NaCl 1.0%。

發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米黃粉蛋白，Mandel鹽培養(yǎng)液。Mandel鹽組成：A鹽：NaNO32.0%，KH2PO41.5%，CaCl20.3 g·L-1，MgSO40.3 g·L-1；B鹽：FeSO4·7H2O 5.0 mg·L-1，MnSO4·H2O 1.6 mg·L-1，ZnSO4·H2O 1.4 mg·L-1，CoCl20.5 mg·L-1。

1.2 方法

利用液體發(fā)酵方法水解玉米黃粉蛋白，通過檢測(cè)蛋白酶的活性，來判斷菌株LN02發(fā)酵玉米黃粉蛋白的效果。首先通過單因素實(shí)驗(yàn)考察底物濃度、發(fā)酵溫度、初始pH值、發(fā)酵時(shí)間、裝料量等因素對(duì)菌株LN02發(fā)酵玉米黃粉蛋白的影響，確定影響玉米黃粉蛋白發(fā)酵的主要因素。在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)4因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)以確定最佳發(fā)酵條件[4]。正交實(shí)驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平

1.3 酶活的測(cè)定

酶活的測(cè)定采用Folin-酚法。

酶活的定義：在30 ℃、pH值7.5的條件下，玉米黃粉蛋白發(fā)酵1 h產(chǎn)生1 μg酪氨酸所用酶量定義為一個(gè)酶活力單位(U)。

U=A/0.5

式中：A為樣品的OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線[5]上對(duì)應(yīng)的酪氨酸量，μg；0.5為反應(yīng)時(shí)間，h。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 底物濃度對(duì)菌株LN02發(fā)酵玉米黃粉蛋白的影響

固定其它條件，考察底物濃度對(duì)菌株LN02發(fā)酵玉米黃粉蛋白的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 底物濃度對(duì)玉米黃粉蛋白發(fā)酵效果的影響

由圖1可看出，隨著底物濃度的增大，蛋白酶活力逐漸升高；當(dāng)?shù)孜餄舛葹?%時(shí)，酶促反應(yīng)的底物基本達(dá)到飽和，蛋白酶活力達(dá)到最高。因此，選擇7%的玉米黃粉蛋白進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 初始pH值對(duì)菌株LN02發(fā)酵玉米黃粉蛋白的影響

固定其它條件，考察初始pH值對(duì)菌株LN02發(fā)酵玉米黃粉蛋白的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 初始pH值對(duì)玉米黃粉蛋白發(fā)酵效果的影響

由圖2可看出，初始pH值為5.5時(shí)，菌株LN02發(fā)酵玉米黃粉蛋白的效果最好。

2.1.3 發(fā)酵溫度對(duì)菌株LN02發(fā)酵玉米黃粉蛋白的影響

固定其它條件，考察發(fā)酵溫度對(duì)菌株LN02發(fā)酵玉米黃粉蛋白的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)玉米黃粉蛋白發(fā)酵效果的影響

由圖3可看出，發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí)，菌株LN02發(fā)酵玉米黃粉蛋白的效果最好。

2.1.4 裝液量對(duì)菌株LN02發(fā)酵玉米黃粉蛋白的影響

培養(yǎng)基中溶解氧影響著菌株LN02的生長(zhǎng)繁殖，進(jìn)而影響發(fā)酵效果。搖瓶中溶解氧的大小主要與轉(zhuǎn)速和裝液量有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)主要從裝液量來考察溶解氧和蛋白酶活力之間的關(guān)系。

固定其它條件，考察裝液量對(duì)菌株LN02發(fā)酵玉米黃粉蛋白的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 裝液量對(duì)玉米黃粉蛋白發(fā)酵效果的影響

由圖4可看出，當(dāng)裝液量為60 mL/250 mL三角瓶時(shí)，菌株LN02發(fā)酵玉米黃粉蛋白的效果最好。

2.1.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株LN02發(fā)酵玉米黃粉蛋白的影響

固定其它條件，考察發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株LN02發(fā)酵玉米黃粉蛋白的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)玉米黃粉蛋白發(fā)酵效果的影響

由圖5可看出，發(fā)酵時(shí)間為4 d時(shí)，菌株LN02發(fā)酵玉米黃粉蛋白的效果最好。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析(表2)

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

由表2可知，各因素對(duì)菌株LN02發(fā)酵玉米黃粉蛋白的影響大小依次為：A>B>C>D，即初始pH值>裝樣量>發(fā)酵溫度>發(fā)酵時(shí)間。確定最佳條件為A2B2C3D3，即初始pH值5.5、裝液量60 mL/250 mL三角瓶、發(fā)酵溫度35 ℃、發(fā)酵時(shí)間5 d。為玉米黃粉蛋白的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了一條新的途徑。

3 結(jié)論

通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，初步確定蛋白酶產(chǎn)生菌LN02發(fā)酵玉米黃粉蛋白的最優(yōu)條件為：初始pH值5.5、裝液量60 mL/250 mL三角瓶、發(fā)酵溫度35 ℃、發(fā)酵時(shí)間5 d。為玉米黃粉蛋白的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了一條新的途徑。

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