異辛烷降解菌的篩選及其降解條件的研究

房 斌，蔣林時

(遼寧石油化工大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院，遼寧 撫順 113001)

汽油是重要的石油制品，主要由C4～C10烷烴組成，其中異辛烷是其主要成分[1]。汽油在使用過程中會不可避免地發(fā)生泄漏和廢棄，造成環(huán)境污染，也會通過呼吸、皮膚接觸、飲食攝入等途徑損傷人體[2，3]。環(huán)境中汽油的降解是混合菌共同作用的結(jié)果，通常不同的降解菌降解不同類型的烴分子[4]。

作者在此從石油污染土壤中篩選、分離純化得到一株能以異辛烷為唯一碳源的菌株，并對其生理生化特性及降解條件進行研究，以期為混合菌株應(yīng)用于石油污染的微生物修復(fù)奠定基礎(chǔ)。

1 實驗

1.1 菌種與培養(yǎng)基

菌種篩選自大慶油田某采油井井臺周圍被石油污染的土壤。

富集培養(yǎng)基(g·L-1)：牛肉膏5，蛋白胨10，NaCl 5，pH值7.0。

無機鹽培養(yǎng)基(g·L-1)：NaNO30.5，NaH2PO41.0，無水CaCl20.1，MgSO4·7H2O 0.2，(NH4)2SO40.5，KH2PO41.0，pH值7.0。

固體培養(yǎng)基[5，6]：各培養(yǎng)基中加入2%(質(zhì)量濃度)瓊脂，pH值7.0。

1.2 方法

1.2.1 菌株的馴化與篩選

取土樣適量，接種于100 mL含500 mg·L-1異辛烷的富集培養(yǎng)基中，于35℃、200 r·min-1搖床培養(yǎng)。按10%(體積分數(shù)，下同)的接種量2 d接種1次，使異辛烷濃度逐漸增至1000 mg·L-1、1500 mg·L-1和2000 mg·L-1。然后用以2000 mg·L-1異辛烷為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基馴化培養(yǎng)4 d。用稀釋平板法將菌液涂布到含500 mg·L-1異辛烷的無機鹽培養(yǎng)基平板上，馴化培養(yǎng)5～7 d，挑取生長良好的單菌落，在富集培養(yǎng)基平板上反復(fù)劃線純化3次，接種于無機鹽試管斜面中，待生長良好置于4℃冰箱保存，備用[7]。

觀察記錄菌株生長情況、菌落特征、菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)、染色反應(yīng)及生理生化反應(yīng)，依據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》對其進行鑒定[8，9]。

1.2.2 異辛烷降解率的測定

將菌株活化液置于含500 mg·L-1異辛烷的無機鹽培養(yǎng)基中，于35℃、200 r·min-1培養(yǎng)72 h，將培養(yǎng)液離心分離(20 min，3000 r·min-1)，取上清液加入0.5%(以樣液體積計)濃硫酸，用20 mL石油醚萃取3次，收集上層清液用無水硫酸鈉脫水，過濾，定容。用紫外分光光度計測定異辛烷殘留量(以吸光度值A(chǔ)217表示)[10，11]，并計算異辛烷的降解率。

1.2.3 菌株生長量的測定

菌株生長量的測定采用光電比濁法[12]。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的篩選分離及鑒定

經(jīng)過反復(fù)馴化、富集培養(yǎng)、劃線分離與純化，篩選到一株具有降解異辛烷能力的菌株，命名為LSH01。

菌落的形態(tài)特征：表面粗糙，呈規(guī)則線形，扁平，乳白色不透明，挑取時有粘性。鏡檢顯示：菌細胞為長桿狀，菌體呈紫色，屬革蘭氏陽性細菌。生理生化特性：氧化酶陽性，吲哚反應(yīng)陰性，氧化葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，接觸酶陽性，V.P反應(yīng)陽性，M.R反應(yīng)陽性，分解含硫氨基酸產(chǎn)硫化氫，產(chǎn)氨實驗陽性，不利用檸檬酸，不水解淀粉，液化明膠，牛奶胨化，還原硝酸鹽。

依據(jù)Bergey分類系統(tǒng)(1994)芽孢桿菌屬的基本特征，初步鑒定菌株LSH01為芽孢桿菌屬(Bacillus)。

2.2 菌株LSH01的生長曲線

將菌株LSH01按10%接種量接種于含500 mg·L-1異辛烷的富集培養(yǎng)基中，于35℃、200 r·min-1搖床培養(yǎng)，定時取樣測定OD600，繪制菌株的生長曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 菌株LSH01的生長曲線

由圖1可知，接種0～10 h，菌株生長量無顯著增加，為延滯期；10～27 h，菌株生長量快速上升，為對數(shù)生長期；27～46 h，為穩(wěn)定生長期；46 h后菌株進入衰亡期。由此可見，菌株LSH01繁殖速度較快、繁殖能力較強、對數(shù)生長期較長，對實際應(yīng)用較有利。

2.3 溫度對菌株LSH01生長和異辛烷降解的影響

菌株LSH01按接種量10%接種，于200 r·min-1、不同溫度下?lián)u床培養(yǎng)72 h，測定異辛烷降解率和菌株生長量，結(jié)果見圖2。

圖2 溫度對菌株LSH01生長和異辛烷降解的影響

由圖2可知，溫度為35℃時菌株生長量和異辛烷降解率最高。這可能是因為，微生物產(chǎn)生的酶有最適溫度，溫度較低時，酶活性受到影響，代謝活性差，微生物生長緩慢，導(dǎo)致異辛烷降解效果下降；溫度較高時，蛋白質(zhì)遭到破壞或凝固，菌株生長受阻，甚至死亡，也導(dǎo)致異辛烷降解效果下降。因此，確定最適溫度為35℃。

2.4 pH值對菌株LSH01生長及異辛烷降解的影響

菌株LSH01按接種量10%接種，于35℃、200 r·min-1搖床培養(yǎng)72 h，考察pH值對異辛烷降解和菌株生長的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 pH值對菌株LSH01生長和異辛烷降解的影響

由圖3可知，pH值為6.0～8.0時，菌株生長良好，pH值為8.0時生長量最高；pH值為4.0～8.0時，隨著pH值的增大異辛烷降解率逐漸升高，pH值為8.0時降解率達到最大值，此后又逐漸下降。因此，確定最適pH值為8.0。

2.5 異辛烷濃度對菌株LSH01生長及異辛烷降解的影響

菌株LSH01按接種量10%接種，于35℃、200 r·min-1搖床培養(yǎng)72 h，考察異辛烷濃度對異辛烷降解和菌株生長的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 異辛烷濃度對菌株LSH01生長和異辛烷降解的影響

由圖4可知，異辛烷濃度為500 mg·L-1時，菌株生長量最高；異辛烷降解率隨著異辛烷濃度的增大逐漸下降。因此，確定最適異辛烷濃度為500 mg·L-1。

2.6 接種量對菌株LSH01生長及異辛烷降解的影響

在35℃、200 r·min-1搖床培養(yǎng)72 h條件下，考察接種量對異辛烷降解和菌株LSH01生長的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 接種量對菌株LSH01生長和異辛烷降解的影響

由圖5可知，異辛烷降解率和菌株生長量隨接種量的增大而升高，但接種量超過15%時，菌株生長量顯著下降。這是因為，隨著接種量的增大，營養(yǎng)物消耗較快，代謝產(chǎn)物積累，菌株生長后期的營養(yǎng)匱乏，生物量減少，從而使菌株生長量下降，降解率趨于平緩。因此，確定最適接種量為15%，此時異辛烷降解率為74.9%。

3 結(jié)論

通過富集培養(yǎng)的方法從土壤中分離得到一株能以異辛烷為唯一碳源的菌株LSH01，經(jīng)形態(tài)特征及生理生化特征鑒定，初步確定為芽孢桿菌屬(Bacillus)。其最適生長溫度為35℃、最適pH值為8.0，在接種量為15%時，500 mg·L-1異辛烷降解72 h的降解率為74.9%。

[1] 董仕寶，胡利明.油品知識漫談—汽油篇[J].石油知識，2009，17(3)：53-54.

[2] 任磊，黃廷林.土壤的石油污染[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境保護，2000，19(6)：360-363.

[3] Water W，Kovalick J R. Trends in implementing innovative technologies in the USA[J].Contaminated Soil，1993，12(3)：201-206.

[4] 金文標(biāo)，宋莉暉，董曉利，等.油污土壤微生物治理的影響因素[J].環(huán)境保護，1998，(10)：27-28.

[5] 諸葛健，沈微.工業(yè)微生物育種學(xué)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006：55-62.

[6] 王蘭，王忠.環(huán)境微生物學(xué)實驗方法與技術(shù)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2009：45-46.

[7] 陳亞麗，張先恩，劉虹，等.甲基對硫磷降解菌假單胞菌WBC-3的篩選及其降解性能的研究[J].微生物學(xué)報，2002，42(4)：490-497.

[8] 東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京：科學(xué)出版社，2001：128-132.

[9] 布坎南R E，吉本斯N E，著，中國科學(xué)院微生物研究所，譯.伯杰氏細菌鑒定手冊(第八版)[M].北京：科學(xué)出版社，1998：117-119.

[10] 國家環(huán)境保護總局.水和廢水監(jiān)測分析方法(第四版)[M].北京：中國環(huán)境科學(xué)出版社，2002：96-97.

[11] 謝重閣.環(huán)境中石油污染物的分析技術(shù)[M].北京：中國環(huán)境科學(xué)出版社，1987：82-83.

[12] 沈萍，范秀榮，李廣武.微生物學(xué)實驗(第三版)[M].北京：高等教育出版社，1999：97-99.