超濾法分離提取雞胸軟骨中硫酸軟骨素和Ⅱ型膠原蛋白

李燕妮

(濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東 煙臺 264003)

硫酸軟骨素(CS)是關(guān)節(jié)軟骨處蛋白多糖形成所必需的一類粘多糖，平均分子量為25～55 kDa，主要用于某些神經(jīng)性頭痛、神經(jīng)痛、關(guān)節(jié)痛、偏頭痛、動脈粥樣硬化以及由鏈霉素引起的聽覺障礙及肝炎的輔助治療。實驗表明，口服硫酸軟骨素可以逐步緩解關(guān)節(jié)變性病癥狀，減少對非甾體類抗炎藥(NSAIDs)的依賴[1]。通常認(rèn)為硫酸軟骨素是通過提高內(nèi)源性合成和防止酶降解關(guān)節(jié)粘多糖來改善關(guān)節(jié)功能。

風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是人體常見的自身免疫性疾病，其病因是T細(xì)胞對關(guān)節(jié)軟骨的抗原反應(yīng)所致。而Ⅱ型膠原蛋白是關(guān)節(jié)軟骨中的主要蛋白，因而是潛在的自身抗原。雞Ⅱ型膠原蛋白具有類似的抗原型，口服后能誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生免疫耐受，從而抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病?？诜┝侩uⅡ型膠原蛋白可緩解風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人疼痛、僵直等癥狀[2]。

雞胸軟骨中富含硫酸軟骨素和純度較高的Ⅱ型膠原蛋白[3]，與牛的氣管軟骨和鯊魚軟骨相比，去除雞胸肉后的雞胸軟骨非常容易收集。作者在此先用木瓜蛋白酶處理雞胸軟骨，然后采用超濾技術(shù)分離提取硫酸軟骨素和Ⅱ型膠原蛋白[4～6]。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

雞胸軟骨。

木瓜蛋白酶(Papain)；硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)品，中國藥品生物制品檢定所；其它試劑均為分析純。

高速冷凍離心機(jī)，德國Heraeus公司；Minimate TFF system型超濾機(jī)，英國PALL公司；7550型紫外可見分光光度計，惠普上海儀器有限公司。

1.2 方法

超濾法分離提取雞胸軟骨中硫酸軟骨素和Ⅱ型膠原蛋白的工藝流程如圖1所示。

圖1 超濾法提取雞胸軟骨中硫酸軟骨素和Ⅱ型膠原蛋白的工藝流程

1.2.1 雞胸軟骨的水解

取1 kg冷凍后的鮮雞胸軟骨，勻漿后加入5000 mL純化水，調(diào)pH值至7.5～8.0，加入4.0 g(相當(dāng)于雞胸軟骨質(zhì)量的0.4%)木瓜蛋白酶于50℃水解6 h，調(diào)節(jié)pH值至6.0，85℃滅活10 min，水解液離心，過濾，澄清。

1.2.2 硫酸軟骨素的分離提取

雞胸軟骨水解液在超濾前需進(jìn)行預(yù)處理以去除不溶雜質(zhì)，降低超濾膜受損的風(fēng)險。由于硫酸軟骨素的分子量為20～30 kDa，所以本實驗先用0.45 μm微孔濾膜澄清水解液，再分別選用截留分子量為8 kDa、10 kDa和30 kDa的超濾膜分離純化硫酸軟骨素，比較硫酸軟骨素收率和超濾時間，以確定分離提取硫酸軟骨素的超濾膜規(guī)格。

1.2.3 Ⅱ型膠原蛋白的分離提取

水解后的Ⅱ型膠原蛋白產(chǎn)物為分子量為1～5 kDa的多肽，所以超濾后的透過液即為分離得到的Ⅱ型膠原蛋白，選用截留分子量為0.6 kDa、1 kDa和3 kDa的超濾膜分離提?、蛐湍z原蛋白，比較Ⅱ型膠原蛋白收率和超濾時間，以確定分離提?、蛐湍z原蛋白的超濾膜規(guī)格。

1.3 分析方法

硫酸軟骨素含量采用CPC(十六烷基氯化吡啶)滴定法測定；蛋白質(zhì)含量采用福林酚法測定；無機(jī)鹽含量采用灼燒殘渣法測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 雞胸軟骨的主要成分

將鮮雞胸軟骨充分水解后，分別用CPC滴定法、福林酚法和灼燒殘渣法測定硫酸軟骨素、Ⅱ型膠原蛋白和無機(jī)鹽的含量，依次為5.2%、5.1%、2.5%。

2.2 超濾工藝的確定

合適的超濾膜可以在最大程度截留處理對象(這里指硫酸軟骨素)的同時，將盡可能多的雜質(zhì)分開。超濾膜截留分子量較小，會實現(xiàn)更高的收率，但膜通量也會有所下降，從而延長了處理時間。因此，膜通量和選擇性是兩個相互矛盾的參數(shù)，必須綜合考察膜通量和選擇性，以選擇最適合的膜組件。

2.2.1 硫酸軟骨素的分離提取

取澄清后的雞胸軟骨水解液分成等體積的3份，控制超濾膜進(jìn)口壓力為0.3 MPa、溫度為10℃，在回流液中補(bǔ)加純化水，等體積(保持回流液總量不變)超濾至透過液電導(dǎo)率低于600 μS·cm-1時，比較3種規(guī)格超濾膜對硫酸軟骨素的收率和超濾時間，結(jié)果見表1。

由表1可見，采用截留分子量為8 kDa和10 kDa的超濾膜分離提取硫酸軟骨素，收率較高，30 kDa的超濾膜則有部分透過。但由于截留分子量為8 kDa的超濾膜耗時較長，并且由于截留分子量小，對較大分子量雜質(zhì)的除去效果不如10 kDa的超濾膜。因此，選擇截留分子量為10 kDa的超濾膜分離提取硫酸軟骨素，收率達(dá)97.1%。

表1 提取硫酸軟骨素用超濾膜的選擇

超濾可以分離除去大部分的無機(jī)鹽和小分子肽，并通過檢測透過液電導(dǎo)率反映除去效果。隨著超濾時間的延長，回流液中蛋白質(zhì)或肽含量逐漸降低；但即使無時間限制地超濾下去，最終還是有大約20%(以軟骨總蛋白質(zhì)質(zhì)量計)的蛋白質(zhì)留在了10 kDa超濾膜的濃縮液里。這是因為木瓜蛋白酶水解后的硫酸軟骨素通常仍帶有1～5個氨基酸殘基，故超濾不能完全去除硫酸軟骨素中的蛋白質(zhì)。

2.2.2 Ⅱ型膠原蛋白的分離提取

取超濾后的透過液分成等體積的3份，控制超濾膜進(jìn)口壓力為0.6 MPa、溫度為10℃，在回流液中補(bǔ)加純化水，等體積超濾至透過液電導(dǎo)率低于200 μS·cm-1后，比較3種規(guī)格超濾膜對Ⅱ型膠原蛋白的收率和超濾時間，結(jié)果見表2。

表2 提?、蛐湍z原蛋白用超濾膜的選擇

由表2可見，采用截留分子量為0.6 kDa、1 kDa和3 kDa的超濾膜分離提取Ⅱ型膠原蛋白，收率依次降低，但沒有顯著差異，由于截留分子量為3 kDa的超濾膜耗時最短，因此，選擇截留分子量為3 kDa的超濾膜分離提?、蛐湍z原蛋白，收率達(dá)95.1%。

3 結(jié)論

以雞胸軟骨為原料，用木瓜蛋白酶處理雞胸軟骨以實現(xiàn)高效率的水解，水解液用截留分子量為10 kDa的超濾膜，在0.3 MPa、10℃分離提取硫酸軟骨素，收率達(dá)97.1%；超濾透過液用截留分子量為3 kDa的超濾膜，在0.6 MPa、10℃分離提取Ⅱ型膠原蛋白，收率達(dá)95.1%。超濾技術(shù)可以實現(xiàn)常溫分離和濃縮，能耗低，回收率高，操作簡單易行，易于工業(yè)化生產(chǎn)。

[1] Weiner H L. Oral tolerance：Immune mechanisms and treatment of autoimmune diseases[J]. Immunology Today，1997，18(7)：335-343.

[2] Cho So Yean，Sim Joon-Soo，Jeong Choon Sik，et al. Effects of low molecular weight chondroitin sulfate on type Ⅱ collagen-induced arthritis in DBA/1J mice[J]. Biol Pharm Bull，2004，27(1)：47-51.

[3] Luo X M，F(xiàn)osmire G J，Leach R M. Chicken keel cartilage as a source of chondroitin sulfate[J]. Poultry Science，2002，81(7)：1086-1089.

[4] 李燕妮.超濾法分離純化刺參酸性粘多糖工藝研究[J].化學(xué)與生物工程，2009，26(1)：39-41.

[5] 紀(jì)存朋，于建生，黃淑燕.膜系統(tǒng)在生物技術(shù)中應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].化學(xué)工業(yè)與工程技術(shù)，2009，30(5)：24-28.

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