大孔吸附樹(shù)脂純化山藥總皂苷的工藝研究

平 靜， 李 清， 陳曉輝， 畢開(kāi)順

(沈陽(yáng)藥科大學(xué)中藥學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110016)

山藥Dioscoreae Rhizoma為薯蕷科植物薯蕷Dioscorea opposita Thumb的干燥根莖，收載于《中國(guó)藥典》2010年版一部，但其項(xiàng)下僅有性狀、鑒別和炮制等項(xiàng)目［1］。山藥藥性甘平，歸脾、肺、腎經(jīng)。具有補(bǔ)脾養(yǎng)胃、生津益肺、補(bǔ)腎澀精之功效，化學(xué)成分主要有蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪酸類化合物、多糖類化合物、微量元素、皂苷類化合物［2-4］。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)山藥的研究以多糖為主要研究對(duì)象，而對(duì)其皂苷類成分研究報(bào)道很少［5-7］，迄今為止尚無(wú)對(duì)山藥總皂苷的純化工藝研究報(bào)道。皂苷類化合物主要含有薯蕷皂苷(dioscin)、原屬于皂苷(protodioscin)，現(xiàn)代研究證實(shí)其抗腫瘤、抗炎、心血管保護(hù)等活性顯著，具有很高的藥用價(jià)值［8-12］。因此，富集純化皂苷類化合物具有廣泛意義。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化山藥總皂苷大孔吸附樹(shù)脂純化工藝研究，為山藥資源的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

UV-265FW紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司);HY-4調(diào)速多用振蕩器(大地自動(dòng)化儀器廠);RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);KQ5200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

山藥飲片(河南省焦作市中藥材飲片廠，經(jīng)沈陽(yáng)藥科大學(xué)賈英副教授鑒定為正品);薯蕷皂苷對(duì)照品(實(shí)驗(yàn)室自制，純度 ＞98%);大孔吸附樹(shù)脂 AB-8，HPD100，HPD300，HPD600(滄州寶恩化工有限公司)和D101(天津市瑞金特化學(xué)品有限公司);水為重蒸水，無(wú)水乙醇、甲醇、香草醛、冰醋酸、高氯酸均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 山藥總皂苷UV-VIS分光光度法測(cè)定方法的建立 取薯蕷皂苷對(duì)照品10 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。精密量取對(duì)照品溶液1 mL置具塞試管中，揮干溶劑，精密加入新鮮配制的5%香草醛-冰乙酸溶液 0.2 mL，高氯酸0.8 mL，加塞，于60℃水浴中反應(yīng)15 min，取出，冷卻至室溫，精密加入冰乙酸5.0 mL，搖勻，以相應(yīng)試劑為空白，采用島津UV-265FW紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在455 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。精密量取對(duì)照品溶液 0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mL，分別置具塞試管中，按相同方法處理后，在455 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，質(zhì)量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到回歸方程為y=2.964 x+0.0155，r=0.9997，線性范圍為 0.0612 ～0.3060 mg。

2.2 山藥乙醇粗提物的制備 稱取山藥飲片粉末(過(guò)40目篩)200 g，用30倍體積60%乙醇回流提取3次，每次2 h，過(guò)濾殘?jiān)?，合并濾液，蒸干溶劑，制備成山藥乙醇粗提物，干燥保存，用于以下工藝研究。

式中:C0為吸附前溶液中皂苷初始質(zhì)量濃度(mg/mL);C1為吸附后溶液中皂苷質(zhì)量濃度(mg/mL);C2為解吸液中皂苷質(zhì)量濃度(mg/mL)。

表1 不同型號(hào)大孔吸附樹(shù)脂對(duì)總皂苷的吸附解吸性能

由表1可知，AB-8的吸附率最高，HPD600的解吸率最高，AB-8次之，然而HPD600的吸附率最低，綜合考慮，采用AB-8大孔吸附樹(shù)脂純化山藥總皂苷。

2.4 AB-8大孔吸附樹(shù)脂上樣吸附時(shí)間的考察 分別準(zhǔn)確稱取0.5 g預(yù)處理過(guò)的AB-8大孔吸附樹(shù)脂置于6個(gè)100 mL三角瓶中，分別加入含山藥總皂苷1 mg的粗提物水溶液，靜置 0.5、1、2、4、6、8 h。測(cè)定吸附后的皂苷質(zhì)量濃度，計(jì)算吸附率。見(jiàn)圖1。

如圖1所示，吸附時(shí)間達(dá)4 h前，山藥總皂苷的吸附率明顯提高，而4 h之后則無(wú)明顯增加，因此，上樣吸附時(shí)間確定為4 h。

2.5 AB-8大孔吸附樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附量的考察 山藥總皂苷樣品液(0.1176 mg/mL)按體積流量1.5 BV/h不斷加入到預(yù)處理的AB-8大孔吸附樹(shù)脂柱，柱體積為40 mL，每10 mL收集1個(gè)流份，測(cè)定每個(gè)流份中山藥總皂苷的量，繪制動(dòng)態(tài)泄漏曲線。見(jiàn)圖2。

圖1 AB-8大孔吸附樹(shù)脂上樣吸附時(shí)間的考察

圖2 AB-8大孔吸附樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附量的考察

如圖2所示，隨著上樣量的增加，流出液中總皂苷的量也隨之增加，當(dāng)加樣量達(dá)到200 mL時(shí)，即總皂苷加入23.52 mg時(shí)，流出液中總皂苷量達(dá)到穩(wěn)定，即大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附達(dá)到飽和，繼續(xù)上樣會(huì)導(dǎo)致總皂苷隨流出液流出而損失，由此確定動(dòng)態(tài)最大上樣量。

2.6 AB-8大孔吸附樹(shù)脂上樣質(zhì)量濃度的考察 經(jīng)預(yù)處理的AB-8樹(shù)脂濕法裝柱，柱體積為40 mL，分別加入山藥總皂苷質(zhì)量濃度為2、4、6、8 mg/mL的粗提物水溶液(總上樣量為20 mg)，上樣吸附時(shí)間為4 h，分別測(cè)定流出液中總皂苷質(zhì)量濃度，計(jì)算吸附率。見(jiàn)圖3。

圖3 AB-8大孔吸附樹(shù)脂上樣質(zhì)量濃度的考察

如圖3所示，隨著上樣質(zhì)量濃度的增加，樹(shù)脂對(duì)山藥總皂苷的吸附能力有所下降，當(dāng)上樣質(zhì)量濃度為4 mg/mL時(shí)吸附率最高，因此，上樣質(zhì)量濃度確定為4 mg/mL。

2.7 AB-8大孔吸附樹(shù)脂洗脫溶劑的考察 經(jīng)預(yù)處理的AB-8大孔吸附樹(shù)脂濕法裝柱，柱體積為40 mL，加入含山藥總皂苷20 mg的粗提物水溶液，上樣吸附時(shí)間為4 h，依次用蒸餾水，15%、30%、50%、70%、95%乙醇溶液各4 BV洗脫，每個(gè)濃度收集為一個(gè)流份，分別測(cè)定各洗脫流份中總皂苷的質(zhì)量。見(jiàn)表2。

表2 AB-8大孔吸附樹(shù)脂洗脫溶劑的考察 (n=3)

由表2可知，水和15%乙醇幾乎不能把山藥總皂苷洗脫下來(lái)，30%，50%，70%乙醇對(duì)于山藥總皂苷均有一定的洗脫能力，其中50%的乙醇洗脫能力最強(qiáng)，而且把皂苷基本洗脫完全。因此，確定首先以水和15%乙醇洗去雜質(zhì)，再以50%乙醇進(jìn)行洗脫。

2.8 AB-8大孔吸附樹(shù)脂洗脫體積的考察 經(jīng)預(yù)處理的AB-8大孔吸附樹(shù)脂濕法裝柱，柱體積為40 mL，加入含山藥總皂苷20 mg的粗提物水溶液，上樣吸附時(shí)間為4 h，先用蒸餾水洗至無(wú)色，再用15%乙醇洗去雜質(zhì)，然后用50%乙醇進(jìn)行洗脫，洗脫液每40 mL(一個(gè)柱體積)為一個(gè)收集單位，至流出液無(wú)皂苷反應(yīng)，分別測(cè)定每份洗脫液中總皂苷的質(zhì)量。見(jiàn)表3。

表3 AB-8大孔吸附樹(shù)脂洗脫體積的考察 (n=3)

由表3可知，5 BV即可將皂苷洗脫完全，因此，確定洗脫體積為5 BV。

2.9 AB-8大孔吸附樹(shù)脂洗脫體積流量的考察 經(jīng)預(yù)處理的AB-8樹(shù)脂濕法裝柱，柱體積為40 mL，加入含山藥總皂苷20 mg的粗提物水溶液，上樣吸附時(shí)間為4 h，先用蒸餾水洗至無(wú)色，再用15%乙醇出去雜質(zhì)，然后用50%乙醇洗脫5 BV，洗脫體積流量分別為 1.5、3、5、7 BV/h，收集洗脫液，分別測(cè)定每份洗脫液中總皂苷的質(zhì)量。見(jiàn)圖4。

圖4 AB-8大孔吸附樹(shù)脂洗脫體積流量的考察

由圖4可知，隨著洗脫流速的增加，解吸率有明顯降低，因此，增加流速并不能提高山藥總皂苷的解吸效率，應(yīng)選擇1.5BV/h 較為適宜。

2.10 AB-8大孔吸附樹(shù)脂上樣pH值的考察 經(jīng)預(yù)處理的AB-8樹(shù)脂濕法裝柱，柱體積為40 mL，加入含山藥總皂苷20 mg的粗提物水溶液，上樣pH分別為4，7，9，上樣吸附時(shí)間為4 h，先用蒸餾水洗至無(wú)色，再用15%乙醇除去雜質(zhì)，然后用50%乙醇洗脫5 BV，洗脫體積流量為1.5 BV/h，收集洗脫液，分別測(cè)定每份洗脫液中總皂苷的質(zhì)量。見(jiàn)圖5。

圖5 AB-8大孔吸附樹(shù)脂上樣pH值的考察

由圖5可知，上樣pH對(duì)吸附率的影響并不明顯，考慮操作簡(jiǎn)便，節(jié)省成本，山藥總皂苷的上樣pH值選為7。

2.11 驗(yàn)證試驗(yàn) 按以上工藝優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明該工藝穩(wěn)定可行，總皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到52.1%。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 (n=3)

3 討論

3.1 山藥中皂苷多為甾體皂苷，由非極性的甾體苷元和極性的糖基組成，整個(gè)分子顯示強(qiáng)極性，而在水溶液中苷元部分可通過(guò)疏水作用與樹(shù)脂的疏水表面相吸附。因此，皂苷類既可以被非極性樹(shù)脂吸附，也可以被極性的樹(shù)脂吸附。本試驗(yàn)結(jié)果表明，弱極性樹(shù)脂對(duì)山藥中皂苷的吸附較強(qiáng)。

4.2 本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)大孔吸附樹(shù)脂純化山藥總皂苷工藝的研究，確定純化工藝為:采用AB-8型大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行純化，上樣pH為7，上樣吸附時(shí)間為4 h，上樣質(zhì)量濃度為4 mg/mL，洗脫體積流量為1.5 BV/h，經(jīng)水和15%乙醇除去雜質(zhì)，然后用50%乙醇洗脫5 BV。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，在該工藝下，總皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)50%以上。

4.3 中藥成分較復(fù)雜，通過(guò)現(xiàn)代中藥純化技術(shù)，可使中藥提取物的純度提高，從而提高療效，降低不良反應(yīng)。大孔吸附樹(shù)脂法純化中藥，為進(jìn)一步成型工藝及質(zhì)量控制提供便利形式。本試驗(yàn)采用AB-8大孔吸附樹(shù)脂純化山藥總皂苷吸附效果好、解吸附條件溫和，使有效成分高度富集，穩(wěn)定性好，受pH、溫度和其他因素影響小，容易再生、可以多次反復(fù)使用，具有較廣闊的工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用前景。

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