升麻提取物純化工藝研究

靳 波， 劉友平* ， 陳鴻平， 彭 月， 趙祎姍

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川成都611137;2.中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川成都611137)

升麻為毛茛科植物大三葉升麻Cimicifuga heracleifolia Kom.、興安升麻C.Dahurica(Turcz.)Maxim.或升麻C.foetida L.的干燥根莖［1］，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品。升麻中主要有效成分為酚酸類［2］及三萜皂苷類［3］。現(xiàn)代藥理試驗(yàn)研究表明升麻提取物中的酚酸類化合物具有抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱及抗血小板聚集等作用［4］，三萜皂苷類化合物具有抗過(guò)敏、抗骨質(zhì)疏松、保肝、抗病毒、緩解婦女更年期綜合癥等作用［5-6］。植物提取物由于其天然優(yōu)勢(shì)，世界植物市場(chǎng)對(duì)其需求非常大，目前已經(jīng)成為拉動(dòng)中藥商品出口的主動(dòng)力［7-9］。本試驗(yàn)以總酚酸(阿魏酸、異阿魏酸和咖啡酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和計(jì)，HPLC法)和總?cè)圃碥?以升麻苷H-1計(jì)，UV法)按權(quán)重系數(shù)1∶1為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)升麻提取物純化工藝進(jìn)行系統(tǒng)研究，為升麻提取物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。

1 材料

Agilent Technologies 1200 Series高效液相色譜儀(Agilent chemstation工作站，DAD檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫公司);UV-1100紫外可見分光光度計(jì);BS200S型萬(wàn)分之一、BP211D型十萬(wàn)分之一電子天平;SHA-C恒溫水浴振蕩器。阿魏酸(批號(hào)110773-200611)、異阿魏酸(批號(hào)111698-200602)和咖啡酸(批號(hào)110885-200102)對(duì)照品由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供;升麻苷 H-1為自制，純度 ＞98%［10］。

2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

2.1 總酚酸測(cè)定 采用HPLC法，以升麻中阿魏酸、異阿魏酸和咖啡酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和計(jì)。采用Hypersil BDS C18(200 mm ×4.6 mm，5 μm)色譜柱，乙腈 -0.1% 磷酸水(15 ∶85)為流動(dòng)相，測(cè)定波長(zhǎng)為316 nm，體積流量為1.0 mL/min，柱溫為30℃。

2.2 總?cè)圃碥諟y(cè)定 采用比色法，以升麻苷H-1為對(duì)照品，測(cè)定升麻提取物中總?cè)圃碥?。?%香草醛-高氯酸(1∶4)為顯色體系，于60℃水浴中加熱15 min，置冰水中冷卻2 ～3 min，于537 nm 處測(cè)定吸光度［11］。

2.3 純化工藝研究

2.3.1 樹脂預(yù)處理 樹脂使用前一般需預(yù)處理，采用95%乙醇浸泡至充分溶脹。

2.3.2 沉降密度測(cè)定 取烘干樹脂，稱質(zhì)量w(g)，裝柱，用95%乙醇洗脫，當(dāng)流出乙醇液與蒸餾水(1∶3)混合不呈白色混濁時(shí)，用蒸餾水洗至沒(méi)有乙醇味，測(cè)定樹脂體積V，用公式ρ=W·V-1，結(jié)果見表1。

表1 各型樹脂的沉降密度

2.3.3 上柱液制備 將最佳工藝條件［12］提取的升麻提取液回收乙醇至無(wú)醇味，加水稀釋，離心，取上清液。

2.3.4 樹脂性能選擇 取質(zhì)量相同的各型樹脂置具塞錐形瓶中，分別加入120 mL上柱液，振搖，吸附完全后，濾過(guò)，盡量避免樹脂的損失;將過(guò)濾完全的樹脂轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，加入過(guò)量的95%的乙醇，計(jì)算吸附率和解吸率，結(jié)果見表2。

表2 總酚酸和總皂苷的吸附率和解吸率

由表2可知，AB-8和LSA-20大孔吸附樹脂解吸效果相近，但AB-8較LSA-20吸附量大，尤其對(duì)酚酸類成分，且常用，易于購(gòu)買，價(jià)格相對(duì)低廉，結(jié)合工業(yè)生產(chǎn)情況，故選擇AB-8型大孔吸附樹脂純化升麻提取物。

2.3.5 上柱藥液濃度考察 在保證所上藥材質(zhì)量相同的條件下，取上柱藥液，配置成不同質(zhì)量濃度，通過(guò)裝有4gAB-8樹脂的吸附柱中，為保證吸附完全，體積流量應(yīng)控制在2～3 mL/min，測(cè)定流出液中指標(biāo)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，計(jì)算比吸附量，結(jié)果見表3。

表3 上樣液質(zhì)量濃度考察

結(jié)果表明，上柱藥液生藥質(zhì)量濃度為0.14 g/mL吸附效果最好。

2.3.6比上柱量考察 將最佳質(zhì)量濃度的藥液120 mL通過(guò)裝有約2g的AB-8型樹脂柱，分段收集流出液，每份10 mL，測(cè)定流出液中總酚酸量和總皂苷量，繪制動(dòng)態(tài)泄漏曲線，計(jì)算泄漏百分率。結(jié)果見表4和見圖1。

由泄露曲線表和圖1可以看出，上樣至第8份時(shí)總酚酸和總皂苷累積泄露百分率均超過(guò)5%，故比上柱量為4.9 g/g。

2.3.7 洗脫溶媒選擇 依照上述工藝條件，量取生藥0.14 g/mL上柱液100 mL，通過(guò)AB-8型大孔吸附樹脂，依次用蒸餾水和不同含乙醇量(10%、20%、30%、40%、50%、70%、95%)各4BV洗脫，測(cè)定洗脫液中總酚酸量、總皂苷量及固形物量，計(jì)算洗脫率和綜合評(píng)分。結(jié)果見表5。

從洗脫率、固形物量綜合評(píng)價(jià)，選擇40%乙醇為洗脫劑。

2.3.8 溶媒用量選擇 量取最佳濃度的上柱液90 mL，通過(guò)樹脂柱，依次用蒸餾水4BV、40%乙醇5BV洗脫，為保證吸附完全，體積流量為2～3 mL/min，同時(shí)以1BV/份收集流份。測(cè)定各流份中總酚酸和含總皂苷量及固形物量，計(jì)算洗脫率。結(jié)果見表6。

從固形物的得率，有效成分的保留率和解吸率確定最終工藝為:蒸餾水2BV，40%乙醇5BV，收集40%乙醇洗脫部位。

表4 最大上樣量考察

圖1 泄漏曲線

2.3.9 工藝驗(yàn)證 量取生藥質(zhì)量濃度為0.14 g/mL的上樣藥液300 mL，按上述確定工藝依法上柱，平行3份，分別用蒸餾水2BV、40%乙醇5BV洗脫。測(cè)定40%乙醇部位各流份中總酚酸量、總皂苷量和固形物量，計(jì)算洗脫率及精制度。結(jié)果見表7。

表5 洗脫溶媒的考察

表6 洗脫溶媒用量考察

表7 工藝參數(shù)驗(yàn)證性試驗(yàn)

結(jié)果表明:升麻總提物經(jīng)大孔樹脂純化后有效地降低了固形物的量，提高了總酚酸和總皂苷的量，總酚酸和總皂苷量的平均精制度分別達(dá)426.00%和400.12%，RSD分別為1.50%和 1.37%，該工藝穩(wěn)定、可行。

3 結(jié)果與討論

3.1 試驗(yàn)首次以升麻中兩大活性成分——酚酸類和三萜皂苷類為指標(biāo)，對(duì)升麻提取物的純化工藝進(jìn)行研究，達(dá)到了較好的純化效果，且工藝穩(wěn)定、可行。

3.2 由于咖啡酸的極性較大，在蒸餾水洗去水溶性雜質(zhì)時(shí)容易被洗脫下來(lái)，故實(shí)驗(yàn)過(guò)程中蒸餾水最佳用量為2BV。

3.3 試驗(yàn)有待于對(duì)純化的提取物中大孔樹脂的殘留和藥效學(xué)做進(jìn)一步的研究。

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