桑樹硬枝扦插生根過程中相關(guān)生理生化指標(biāo)的動(dòng)態(tài)分析

劉明魯 孫 磊，2 張曉峰 聶 浩 程嘉翎，2

(1江蘇科技大學(xué)，江蘇鎮(zhèn)江 212003; 2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所，江蘇鎮(zhèn)江 212018)

桑樹屬?？粕僦参铮俏覈匾慕?jīng)濟(jì)樹種。扦插作為桑樹無性繁殖技術(shù)之一，不僅具有保持母株優(yōu)良特性的優(yōu)點(diǎn)，而且具有操作簡單易行、育苗周期短等特點(diǎn)。但由于桑樹枝條難以生根，扦插繁殖成活率低，因此制約了桑樹扦插繁殖技術(shù)的推廣應(yīng)用。目前，曹邦華等［1］對(duì)桑樹硬枝扦插過程中插穗基部的過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、吲哚乙酸氧化酶(IAAO)的動(dòng)態(tài)活性變化進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)這3種酶活性的動(dòng)態(tài)變化與生根過程密切相關(guān)，而對(duì)桑樹硬枝扦插過程中營養(yǎng)物質(zhì)含量和抗氧化酶系統(tǒng)活性變化的分析鮮見報(bào)道，且都將插穗基部作為研究重點(diǎn)，并未將頂芽下皮部和插穗基部作為一個(gè)上下聯(lián)動(dòng)的整體進(jìn)行研究;為此我們將插穗基部皮層和頂芽下皮部(上部皮層)作為一個(gè)聯(lián)動(dòng)系統(tǒng)，研究分析了插穗皮層的含水率、營養(yǎng)物質(zhì)、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、氧化酶類的動(dòng)態(tài)變化，并探討了這些因子對(duì)桑樹扦插生根的影響，以期為桑樹優(yōu)良品種硬枝扦插繁育技術(shù)的改進(jìn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及主要試劑

1.1.1 供試材料 桑品種:育71－1，選用1年生硬枝枝條的中下部剪制插穗，采自鎮(zhèn)江桑樹國家資源圃，樹齡4年。

1.1.2 主要試劑 愈創(chuàng)木酚、DTT，為 BBI分析純生化試劑，其余試劑均為國藥分析純。

1.1.3 主要儀器 超低溫冷凍儲(chǔ)藏箱(中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司)，LAB TECH紫外分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器廠)，雷磁PHS－2F型pH計(jì)(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，ROTANTA380R型冷凍離心機(jī)(Hettich ZENTRIFUGEN)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 桑樹硬枝扦插及發(fā)育過程形態(tài)表征調(diào)查2011年2月底進(jìn)行扦插，在鎮(zhèn)江桑樹國家資源圃中剪取育71－1硬枝插條，剪成17 cm長的插穗1200余根，頂芽距上切口1.5 cm。采用地加溫線溫床扦插方法，扦插前用消毒凈(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所附屬蠶藥廠生產(chǎn))對(duì)溫床進(jìn)行消毒，將焦糠充分吸水后置于溫床中，參照文獻(xiàn)［2］的技術(shù)處理插穗并扦插，溫度控制在28℃，相對(duì)濕度70% ～80%。扦插時(shí)插穗在溫床上部露出第1個(gè)芽，扦插后定期噴水。每隔3 d進(jìn)行1次生根形態(tài)觀察;扦插21 d時(shí)隨機(jī)抽取50根插穗，調(diào)查扦插生根率、生根插條的平均生根數(shù)、根長，3次重復(fù)。

1.2.2 桑樹硬枝扦插生根過程中含水率、營養(yǎng)物質(zhì)、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的測定 扦插的育71－1插穗，自扦插之日起，每隔3 d取20根插穗基部2 cm范圍內(nèi)的皮層(基部皮層)、插穗頂芽下面2 cm范圍內(nèi)的皮層(上部皮層)，分別剪碎后混合均勻，參照文獻(xiàn)［3］的方法進(jìn)行插穗基部皮層、上部皮層的含水率、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量的測定，參照文獻(xiàn)［4］的方法進(jìn)行插穗基部皮層、上部皮層脯氨酸含量的測定。

1.2.3 扦插生根過程中抗氧化酶活性及生根關(guān)聯(lián)酶活性的測定 檢測樣品取樣同1.2.2的方法，每個(gè)檢測項(xiàng)目分別準(zhǔn)確稱取0.5 g新鮮插穗基部皮層與上部皮層，用液氮研磨，加入磷酸緩沖液(PBS)5 mL，在冰浴中研磨成漿，11000 r/min離心20 min，取上清液冷藏備用，3次重復(fù)。

參照文獻(xiàn)［3］的方法測定超氧化物歧化酶(SOD)和IAAO的活性，參照文獻(xiàn)［5］的方法測定抗壞血酸過氧化物酶(APX)的活性，參照文獻(xiàn)［4］的方法測定過氧化氫酶(CAT)、POD的活性，參照文獻(xiàn)［6］的方法測定PPO的活性。

SOD活性以抑制NBT光化還原率達(dá)50%的酶量為1個(gè)酶活單位，其結(jié)果以鮮質(zhì)量為U/g表示;APX、CAT、POD以1 g插穗皮層鮮質(zhì)量1 min改變0.01個(gè)OD值為1個(gè)酶活力單位(U/g);PPO以1 g插穗皮層鮮質(zhì)量1 min改變0.1個(gè)OD值為1個(gè)酶活力單位(U/g);IAAO以1 g插穗皮層鮮質(zhì)量在1 h內(nèi)分解破壞吲哚乙酸(IAA)的質(zhì)量(ug)為1個(gè)酶活力單位(U/g)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件和Origin軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 硬枝扦插生根情況及發(fā)育過程形態(tài)表征

育71－1桑樹硬枝插穗?yún)⒄瘴墨I(xiàn)［2］的技術(shù)處理誘導(dǎo)，扦插經(jīng)過21 d時(shí)，插穗生根率達(dá)到87.8%，生根插穗的平均生根數(shù)為19.6根/株，平均根長為3.5 cm。

桑樹硬枝扦插生根形態(tài)學(xué)觀測發(fā)現(xiàn)，插穗扦插3 d后，絕大部分插穗的切口上木質(zhì)部與韌皮部交界處的微管形成層產(chǎn)生了少量的愈傷組織突起，到第6天觀察到插穗切口及以上3 cm區(qū)段部位膨脹并伴有更多的突起;12 d后有大部分的插穗切口以上的皮部突起并伴隨皮孔伸出明顯的不定根尖，18 d后不定根伸長生長且有少量插穗產(chǎn)生2級(jí)側(cè)根;插穗上部皮層無明顯形態(tài)變化，插穗上的頂芽在第6天開始萌動(dòng)，第18天已經(jīng)抽生出新芽(圖1)。據(jù)此，桑樹硬枝扦插生根可大致分為4個(gè)時(shí)期:0～5 d為愈傷組織的誘導(dǎo)期，6～11 d為不定根生成誘導(dǎo)期，12～17 d為生根表達(dá)期，18～21 d為根的伸長期。

圖1 桑樹硬枝扦插過程中插穗基部與插穗頂芽形態(tài)表征變化

2.2 硬枝扦插過程中含水率的變化

桑樹硬枝扦插插穗經(jīng)人工誘導(dǎo)后，插穗基部皮層的含水率穩(wěn)步上升，在第12天時(shí)達(dá)到最大值，之后趨于穩(wěn)定，上部皮層的含水率變化不大;在整個(gè)生根過程中，插穗基部皮層的含水率明顯高于上部皮層的含水率(圖2)。水分作為一個(gè)重要的條件，對(duì)于植物的生存起著決定性的作用;插穗基部從扦插基質(zhì)中吸收水分以適應(yīng)由離體插穗所造成的機(jī)械損傷和水分脅迫，而頂芽下皮部裸露在空氣中，處于室溫條件下，生理活性較低，含水率無明顯變化。

圖2 硬枝扦插過程中含水率的變化

2.3 硬枝扦插過程中營養(yǎng)物質(zhì)含量和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的變化

桑樹硬枝扦插生根過程中，可溶性糖的含量總體呈下降趨勢(shì)，在0～3 d變化得尤為劇烈，說明愈傷組織的誘導(dǎo)形成消耗了大量的可溶性糖，插穗上部皮層的可溶性糖和可溶性蛋白含量均高于插穗基部皮層，并且插穗上部皮層的可溶性蛋白含量變化也呈現(xiàn)出階梯式下降的趨勢(shì)，表明可溶性糖和可溶性蛋白由莖部向基部運(yùn)輸，以滿足基部旺盛的代謝活動(dòng)的需要。而插穗基部皮層的可溶性蛋白含量表現(xiàn)為先下降后上升再下降的趨勢(shì)，這是因?yàn)樵谟鷤M織和不定根誘導(dǎo)期(0～11 d)，大量消耗了可溶性蛋白以產(chǎn)生愈傷組織，導(dǎo)致蛋白質(zhì)含量急劇下降;12～17 d愈傷組織膨大生長，并且部分插穗開始生根，可溶性蛋白稍有上升;18～21 d根系生長，插穗頂芽大部分已萌發(fā)，可溶性蛋白含量略有下降(圖3)。

圖3 硬枝扦插過程中可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量的變化

桑樹硬枝扦插過程中插穗基部皮層和插穗上部皮層的脯氨酸含量和可溶性糖含量變化趨勢(shì)相似，總體呈下降趨勢(shì)，在愈傷組織誘導(dǎo)初期(0～3 d)，插穗基部皮層的脯氨酸含量急劇下降，之后維持恒定水平;而插穗上部皮層的脯氨酸含量則呈現(xiàn)出階梯式下降的趨勢(shì)，表明插穗上部皮層水分、營養(yǎng)和滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)的變化不如插穗基部皮層的變化劇烈，更多的表現(xiàn)出一種階段性變化的趨勢(shì)。(圖3)

2.4 硬枝扦插過程中抗氧化酶類活性變化

植物細(xì)胞內(nèi)存在清除氧自由基的酶促保護(hù)系統(tǒng)和非酶促保護(hù)系統(tǒng)，SOD、APX、CAT、POD是酶促保護(hù)系統(tǒng)中的重要成份。

2.4.1 SOD和APX活性變化 扦插過程中插穗上部皮層的SOD活性均高于插穗基部皮層;而插穗上部皮層的APX活性均低于插穗基部皮層(圖4－5)。SOD是氧自由基清除酶促防御系統(tǒng)中的重要成員，與植物抗氧化能力直接相關(guān)［7］;SOD活性也是衡量生根的重要指標(biāo)［8］。桑樹硬枝扦插過程中的SOD活性和APX活性變化與扦插生根相關(guān)聯(lián)，其在生根過程中呈下降趨勢(shì)。硬枝扦插初期，經(jīng)過人工誘導(dǎo)，離體插條基部通過吸收基質(zhì)水分對(duì)抗機(jī)械損傷和水分脅迫，很快適應(yīng)了環(huán)境，插條遭受氧自由基的危害較小，以后隨著不定根的長出和伸長，逐漸處于有利的生存狀態(tài)。

圖4 硬枝扦插過程中SOD活性變化

圖5 硬枝扦插過程中APX活性變化

2.4.2 CAT活性變化 CAT活性在插穗基部皮層表現(xiàn)出波浪式上升趨勢(shì)，而在插穗上部皮層則表現(xiàn)為先升高后下降再升高的趨勢(shì)(圖6)。O2－經(jīng)過SOD的解毒作用生成H2O2，隨后存在于細(xì)胞質(zhì)中的H2O2主要由2種胞質(zhì)APX清除，而CAT則主要降解過氧化物酶體中的H2O2［9］。

圖6 硬枝扦插過程中CAT活性變化

2.5 硬枝扦插過程中生根關(guān)聯(lián)酶活性變化

2.5.1 POD活性動(dòng)態(tài)變化 從圖7可以看出，插穗基部皮層POD活性呈先升高后下降再升高的趨勢(shì)，而在插穗上部皮層則表現(xiàn)出先略有上升后相對(duì)恒定的趨勢(shì)。POD通過催化H2O2與其他底物反應(yīng)，以消除植物在逆境和衰老情況下產(chǎn)生的H2O2，而減少H2O2對(duì)生物體的傷害作用。POD不僅與植物抗逆和衰老有關(guān)，同時(shí)具有與植物生長素氧化酶相似的性質(zhì)，對(duì)植物的生長有調(diào)節(jié)作用，參與細(xì)胞壁多種結(jié)構(gòu)成分的聚合作用，因此POD活性對(duì)插條生根起著重要的作用。

圖7 硬枝扦插過程中POD活性變化

POD不僅是植物抗氧化酶系統(tǒng)的重要組成部分，而且在扦插生根過程中也發(fā)揮著重要的功能。Garspar等［10］將 POD作為植物插條生根的標(biāo)志之一，植物POD是一類含鐵卟啉輔基的酶，參與了植物體內(nèi)多種生理生化過程，POD在植物體內(nèi)不僅參與了生長素的代謝活動(dòng)，而且對(duì)植物形態(tài)的建成、生長分化也有一定的作用。POD活性在插穗生根的不同時(shí)期呈現(xiàn)出規(guī)律性變化。在整個(gè)扦插階段，插穗基部皮層的POD含量明顯高于插穗上部皮層;插穗基部皮層的POD活性在扦插后3 d上升，3～9 d穩(wěn)定，9～12 d下降，12 d后持續(xù)上升;插穗上部皮層的POD活性在扦插過程中變化不明顯。在愈傷組織和不定根的誘導(dǎo)期(0～9 d)，POD活性上升，消耗體內(nèi)過多的內(nèi)源生長素，有利于誘導(dǎo)根原基發(fā)育;其后9～12 d，POD活性下降，導(dǎo)致體內(nèi)IAA含量上升，有利于不定根的表達(dá);12～21 d生根期間，此時(shí)POD活性穩(wěn)步上升(圖7)，促進(jìn)不定根的形成和根的伸長生長。

2.5.2 PPO活性變化 在桑樹硬枝扦插過程中，插穗基部皮層的PPO活性呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì);在愈傷組織誘導(dǎo)期，PPO活性相繼下降，在不定根的誘導(dǎo)、表達(dá)和伸長期，PPO活性逐漸上升，說明愈傷組織的誘導(dǎo)需要低活性的PPO，而不定根的表達(dá)和伸長需要高活性的PPO，這與曹邦華等［1］的研究結(jié)論一致;而插穗上部皮層的PPO活性在12 d后呈明顯下降趨勢(shì)，15 d之后逐漸上升。插穗基部皮層的PPO活性總體上略高于上部皮層的PPO活性(圖8)。

圖8 硬枝扦插過程中PPO活性變化

PPO的存在對(duì)不定根的形成是十分重要的［11］。高等植物中普遍存在PPO，這是一種含銅的酶，不僅在植物的生長發(fā)育中起著重要作用，而且在植物的器官形態(tài)上也發(fā)揮著重要的功能。酚類物質(zhì)對(duì)不定根的發(fā)生與發(fā)育起著極其重要的作用，PPO的一個(gè)重要生理功能就是催化酚類物質(zhì)與IAA形成一種“IAA－酚酸復(fù)合物”［12］，這種復(fù)合物是一種生根輔助因子，具有促進(jìn)不定根形成的活性［13］。在不定根的誘導(dǎo)期和根的表達(dá)和伸長期，PPO活性較高，因此，形成的IAA－酚酸復(fù)合物較多，有利于不定根的發(fā)育和不定根的誘導(dǎo)，促進(jìn)不定根的形成和根的伸長生長。

2.5.3 IAAO活性變化 在扦插生根過程中，IAAO活性在插穗基部皮層0～5 d愈傷組織誘導(dǎo)期升高，在第6天時(shí)達(dá)到高峰，在根的誘導(dǎo)期急劇下降，在根的表達(dá)和伸長期保持較低水平。而插穗上部皮層的IAAO活性呈現(xiàn)出先上升后下降再上升的總趨勢(shì)，在12 d后持續(xù)小幅上升(圖9)。

圖9 硬枝扦插過程中IAAO活性變化

3 討論

3.1 硬枝扦插生根與含水率、營養(yǎng)物質(zhì)和滲透調(diào)節(jié)物的關(guān)系

桑樹硬枝扦插過程中，插穗基部皮層的含水率先穩(wěn)步升高后趨于穩(wěn)定，上部皮層的含水率無明顯變化;可溶性糖、脯氨酸含量在扦插生根過程中呈下降趨勢(shì)，且在0～3 d表現(xiàn)得極為劇烈，之后趨于平穩(wěn)，可溶性蛋白在插穗基部皮層表現(xiàn)為降—升—降的趨勢(shì)，在插穗上部皮層表現(xiàn)出差異的變化趨勢(shì)。營養(yǎng)物質(zhì)不僅是插穗生根和生長所不可或缺的，而且也是插穗在生根之前維持其生存的重要能源。糖類物質(zhì)是植物體內(nèi)主要的營養(yǎng)儲(chǔ)藏和運(yùn)輸形式，插穗生根與插穗內(nèi)含糖量有關(guān)。脯氨酸是植物中廣泛存在的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，其作用是保持細(xì)胞與環(huán)境滲透平衡，防止水分散失，在水分脅迫時(shí)它能與細(xì)胞內(nèi)的一些化合物形成聚合物，具有保水作用［14］。可溶性蛋白也常作為植物抗逆性指標(biāo)，主動(dòng)參與水分脅迫時(shí)植物的滲透調(diào)節(jié)，是除脯氨酸、可溶性糖外，植物中重要的有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)［15］。這些生理活性物質(zhì)在扦插生根過程中的營養(yǎng)供應(yīng)和滲透調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的功能。

3.2 硬枝扦插生根與抗氧化酶系統(tǒng)的關(guān)系

SOD與CAT、POD、APX協(xié)同作用，可防御活性氧或其他過氧化物自由基對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)的傷害。在扦插過程中，SOD活性和APX活性總體上呈下降趨勢(shì)，而CAT活性和POD活性總體上呈上升趨勢(shì)，SOD、POD、CAT、APX的協(xié)同作用可以將植物體內(nèi)的活性氧維持在較低的水平，以保證其正常的生長代謝。

3.3 硬枝扦插生根與生根關(guān)聯(lián)酶的關(guān)系

POD、PPO、IAAO是目前公認(rèn)的與不定根關(guān)系最密切的3種酶類，它們不僅在植物的生長發(fā)育中起重要的作用，而且在植物的形態(tài)建成中也發(fā)揮著重要的功能。POD活性的高低可作為判定桑樹生根難易的指標(biāo)之一。已有研究發(fā)現(xiàn)［16－17］，POD 活性在扦插生根過程中會(huì)出現(xiàn)2個(gè)高峰，分別參與根的誘導(dǎo)及表達(dá)，POD作用的某些產(chǎn)物可能是不定根發(fā)生和發(fā)展所必需的輔助因子。PPO的重要作用是催化酚類物質(zhì)與IAA綜合形成一種生根輔助因子，即有利于生根的“IAA－酚酸復(fù)合物”。IAAO可以氧化IAA，IAA一個(gè)重要的生理功能就是促進(jìn)不定根的形成，IAA含量的變化勢(shì)必影響不定根的發(fā)生;因此，IAAO活性的大小與根的發(fā)生有非常重要的關(guān)系。Wiesmann等［18］認(rèn)為:在根的誘導(dǎo)期較低的IAAO活性有利于不定根的發(fā)育，從而促進(jìn)不定根的生長;宋金耀等［16］和宋麗紅等［19］發(fā)現(xiàn)，在根的發(fā)生期IAAO活性下降有利于插穗IAA的積累以促進(jìn)根的生長;在桑樹硬枝扦插生根過程中，3種氧化酶活性都呈現(xiàn)規(guī)律性的變化，與不定根的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系非常密切，它們?cè)谏^程中的作用可能是既獨(dú)立又聯(lián)系的，通過相互作用來影響生根。

3.4 硬枝扦插生根與插穗不同部位的關(guān)系

桑樹硬枝扦插時(shí)，焦糠一直埋到頂芽下，插穗基部與芽下皮部在扦插溫床中所處的溫度不同，插穗基部埋于加溫線正上方，為恒溫28℃，芽下皮部為室溫2～12℃，本試驗(yàn)對(duì)第1芽下皮層的相關(guān)生理生化指標(biāo)進(jìn)行了測定，研究分析發(fā)現(xiàn)插穗下部皮層的可溶性糖、脯氨酸、APX活性的變化趨勢(shì)與插穗基部相似，而抗氧化酶系統(tǒng)在桑樹硬枝扦插過程中變化不大;表明扦插生根與插穗上部皮層的抗氧化酶系統(tǒng)關(guān)聯(lián)度不高;生根關(guān)聯(lián)酶中的IAAO和PPO活性在0～12 d與插穗基部皮層變化趨勢(shì)大致相同，12 d之后變化趨勢(shì)相反。12 d為不定根形成期，且頂芽已經(jīng)萌動(dòng)，插穗基部皮層和插穗上部皮層的差異變化可能與酚類物質(zhì)和IAA的極性運(yùn)輸有關(guān)。

本研究將桑樹硬枝扦插過程中插穗基部皮層和插穗上部皮層作為一個(gè)上下聯(lián)動(dòng)的系統(tǒng)，進(jìn)行了相關(guān)生理生化指標(biāo)的測定，研究分析了營養(yǎng)物質(zhì)、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和氧化酶類，在扦插過程中的變化及生根特性和酶活性變化之間的聯(lián)系，但對(duì)桑樹扦插生根機(jī)理的明確解析，還有待于進(jìn)一步的研究?？梢钥紤]從插穗受傷后在特定條件下的信號(hào)傳導(dǎo)，利用抑制消減雜交技術(shù)(SSH)和蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)，對(duì)在扦插過程中成根基因的激活和表達(dá)進(jìn)行更加深入的研究。

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