分析精液蛋白激酶A與男性不育患者精液參數(shù)及精子形態(tài)的關(guān)系

陳鵬勛

（鄭州人民醫(yī)院 檢驗科，河南 鄭州 450000）

蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）普遍存在于真核細(xì)胞，介導(dǎo)跨膜信號的信號傳導(dǎo)，其作用于各種與糖脂代謝相關(guān)的酶類。PKA是精子蛋白酪氨酸磷酸化限速酶，參與精子運動力、精子超激活運動、精子獲能等多種生理生化過程。有研究表明PKA在調(diào)節(jié)精子活力方面起主要作用，可能影響精子形態(tài)，而精子活力和精子形態(tài)影響精子的功能從而直接關(guān)系到男性的生育能力。目前，有關(guān)精液PKA含量與男性不育患者精液主要參數(shù)及精子形態(tài)的相關(guān)性研究較少，且確切關(guān)系仍有爭議。本研究通過對比不同精子活力和精子形態(tài)男性不育患者精液PKA含量，來探討精液PKA含量與男性不育患者精液活力及精子形態(tài)的關(guān)系，以期為男性不育的臨床診斷和治療提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2010年2月－2011年6月我院診治的男性不育患者300例，年齡25～38歲，平均（31.3±3.2）歲，不育年限1～7年，平均（4.0±1.4）年。納入標(biāo)準(zhǔn)：夫婦雙方性生活正常，婚后未避孕1年以上未孕，女方檢查無明顯異常，男方無明顯睪丸、附睪及輸精管異常，無性功能障礙史，無外傷及家族遺傳性病史，無不良生活習(xí)慣（如煙酒等嗜好）；排除染色體檢查異常者。

1.2 方法

（1）精液采集與分析：禁欲3～7天，在實驗室手淫法留取全部精液，置于清潔干燥的取精杯中，37℃水浴待液化后進行精液常規(guī)分析，分析系統(tǒng)采用WLJY9000彩色精子質(zhì)量檢測系統(tǒng)（北京偉力新世紀(jì)科技發(fā)展有限公司）。按第四版《WHO人類精液及精子－宮頸黏液相互作用實驗室檢驗手冊》精液參數(shù)檢測方法檢測。

（2）精液PKA含量的測定：取出酶標(biāo)板，按序在空白微孔中加入50μL標(biāo)準(zhǔn)品。標(biāo)記樣本后加50μL樣本至空白微孔中。在標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中各加入50μL酶標(biāo)記溶液，37℃孵育60min，洗板機清洗5次，靜置10～20s。每孔加入底物呈色劑A液和B液各50μL，37℃下避光孵育15min，后加入50μL終止液終止反應(yīng)。在波長450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的吸光度值（A）。B＝標(biāo)準(zhǔn)品A值，BO＝標(biāo)準(zhǔn)品O點A值，以B／BO%值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，在對數(shù)坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（線性范圍1～100ng／mL）。在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找對應(yīng)的濃度范圍。試劑盒敏感性為1.0ng／mL。

（3）改良巴氏染色：標(biāo)本置于95%乙醇溶液固定5～15min，按WHO推薦的改良巴氏染色法染色、脫水、透明和封片，按Kruger等標(biāo)準(zhǔn)油鏡下每張涂片觀察200個以上精子（只觀察有尾部的可辨認(rèn)完整精子），計錄正常和畸形精子。

（4）參數(shù)記錄和比較：記錄患者年齡、不育年限、精液量、液化時間、精子密度、精子活力、PKA含量。根據(jù)精子活力將患者分為活力正常組（a＋b級精子≥50%）、輕度弱精組（25%＜a＋b級精子＜50%）和重度弱精組（a＋b級精子＜25%）；另根據(jù)精液形態(tài)檢測結(jié)果，將患者分為形態(tài)正常組（正常形態(tài)精子≥14%）和形態(tài)異常組（正常形態(tài)精子＜14%）。比較各組相關(guān)參數(shù)差異。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 不同精子活力組相關(guān)參數(shù)比較

不同精子活力組相關(guān)參數(shù)比較見表1。與活力正常組相比，輕度弱精組和重度弱精組PKA含量明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。輕度弱精組PKA含量明顯降低重度弱精組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 不同精子活力組相關(guān)參數(shù)比較（）

表1 不同精子活力組相關(guān)參數(shù)比較（）

注：＊P＜0.05，與活力正常組比較；＃P＜0.05，與輕度弱精組比較。

活力正常組（n＝114）輕度弱精組（n＝98）重度弱精組（n＝88）30.7±2.7 31.2±3.0 32.2±3.4不育年限（年） 3.8±1.3 4.0±1.5 4.1±1.7精液量（mL） 2.5±0.79 2.4±0.81 2.4±0.78液化時間（min） 40.6±12.5 35.8±12.8 34.6±12.4密度（×106／mL） 76.6±21.6 68.2±23.9 67.6±13.9 PKA含量（ng／mL） 66.9±9.67 58.3±8.89＊ 45.1±8.67＊＃年齡（歲）

2.2 精子形態(tài)正常組和形態(tài)異常組相關(guān)參數(shù)比較

精子形態(tài)正常組和形態(tài)異常組相關(guān)參數(shù)比較見表2。與精子形態(tài)正常組相比，形態(tài)異常組的PKA含量顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 正常形態(tài)組和異常形態(tài)組相關(guān)參數(shù)比較（）

表2 正常形態(tài)組和異常形態(tài)組相關(guān)參數(shù)比較（）

注：＊P＜0.05，與正常組比較。

正常組（n＝147） 異常組（n＝153）30.7±5.7 31.9±5.3不育年限（年） 4.58±2.8 4.32±2.9精液量（mL） 2.7±0.77 2.5±0.71液化時間（min） 39.6±11.5 36.8±12.5 PKA含量（ng／mL） 65.6±8.63 47.2±7.98＊年齡（歲）

3 討論

3.1 PKA的作用基礎(chǔ)

PKA又稱為依賴于cAMP的蛋白激酶A，活化的PKA可作用于各種與糖脂代謝相關(guān)的酶類，一些離子通道和某些轉(zhuǎn)錄因子，使它們發(fā)生磷酸化并改變其狀態(tài)。而精子蛋白酪氨酸磷酸化是精子運動力、精子超激活運動、精子獲能等多種生理生化過程的重要調(diào)控因素。表明PKA在調(diào)節(jié)精子活力方面起主要作用。

另有研究表明AKAP為調(diào)節(jié)精子運動力的支架蛋白，在獲能過程中AKAP3發(fā)生酪氨酸磷酸化將增加與PKA結(jié)合的蛋白，使得PKA在特異細(xì)胞結(jié)構(gòu)中被募集與激活，最終提高精子運動力。

3.2 PKA含量與精子活力之間的關(guān)系

關(guān)于PKA含量與精子活力之間的研究比較多，認(rèn)為PKA含量可以直接影響精子活力。本文也得出了一致的結(jié)論，與活力正常組相比，輕度弱精組和重度弱精組PKA含量明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。分析原因可能是通過調(diào)節(jié)精子尾部動力蛋白表面的亞基磷酸化或通過cAMP／PKA途徑調(diào)整精子活力。

3.3 PKA含量與精子形態(tài)之間的關(guān)系

精子形態(tài)分析一直是男性不育研究的熱點，因為精子形態(tài)直接關(guān)系精子的功能和受精能力。關(guān)于PKA的研究一直較多集中在PKA的作用機理以及它對精子活力的影響，較少見到PKA在精子形態(tài)方面的研究。本文比較不同精子形態(tài)下的PKA含量發(fā)現(xiàn)，與精子形態(tài)正常組相比，形態(tài)異常組的PKA含量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。提示PKA與精子形態(tài)關(guān)系密切，可能通過某種途徑影響精子的發(fā)育和成熟，說明PKA不僅影響精子活力，也可以影響精子形態(tài)。關(guān)于其深層次的機制問題尚需進一步的研究。

綜上所述，PKA含量與精子活力關(guān)系密切，并影響精子形態(tài)，其確切的分子機制仍需進一步研究。

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