培養(yǎng)基不同血清比例對人胃癌SGC－7901細(xì)胞生長的影響

陳舒怡，姜學(xué)偉，趙 剛

（湖北中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430065）

SGC－7901細(xì)胞是20世紀(jì)80年代初由我國上海市第六人民醫(yī)院腫瘤研究組、復(fù)旦大學(xué)遺傳研究所、中國科學(xué)院上海藥物研究所和上海市腫瘤研究所等單位進(jìn)行協(xié)作研究而培養(yǎng)建立的一株胃腺癌細(xì)胞株，腫瘤材料來自于一位56歲的女性胃腺癌患者。在培養(yǎng)過程中，SGC－7901細(xì)胞一直保持惡性上皮樣細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)，如核質(zhì)比較大，多數(shù)細(xì)胞為單核，核仁清晰［1］。

SGC－7901細(xì)胞株自建立以來在腫瘤學(xué)、藥理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等研究領(lǐng)域獲得了廣泛應(yīng)用，對于抗胃癌藥物的藥效評價與作用機(jī)理的揭示以及中草藥植物的抗癌有效成分篩選等方面的研究發(fā)揮了重要作用。

眾所周知，血清是細(xì)胞體外培養(yǎng)時在培養(yǎng)液中不可缺少的營養(yǎng)成分，能為細(xì)胞的生長提供必須的生長因子。目前國內(nèi)的實(shí)驗(yàn)室在培養(yǎng)SGC－7901細(xì)胞時，一般在培養(yǎng)液中加入10%左右比例的新生牛血清或小牛血清［2］。而目前市售國產(chǎn)新生牛血清的價格是每100mL百元人民幣以上，隨著養(yǎng)牛成本的逐年提高，牛血清的價格還會逐步提高。因此在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，血清是花費(fèi)最多的常用試劑。在這種背景下，積極探索低血清細(xì)胞培養(yǎng)條件很有意義。我們根據(jù)腫瘤細(xì)胞能夠自行合成分泌生長因子，對外源血清依賴性較低的理論［3］，嘗試在培養(yǎng)SGC－7901細(xì)胞時，減少培養(yǎng)液中血清的比例。我們利用倒置顯微鏡和酶標(biāo)儀觀察并檢測了該細(xì)胞在3%、6%和9%等血清比例的培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)。

1 材料

1.1 腫瘤細(xì)胞株

人胃癌細(xì)胞株SGC－7901由武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中國典型培養(yǎng)物保藏中心提供。

1.2 主要器材與儀器

低溫冰箱（MDF－192型，日本SANYO公司），CO2培養(yǎng)箱（HF240型，Heal Force公司），低速離心機(jī)（800型，常州國華電器有限公司），超凈臺（YJ－875型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司），倒置顯微鏡（CK40型，日本OLYMPUS公司），高壓滅菌器（常州國華電器有限公司），全自動酶標(biāo)儀（Model 680型，BIO－RAD公司），微量移液器（10μL，200μL，1000μL，5mL上海大龍公司），T－25培養(yǎng)瓶（日本IWAKI公司），96孔培養(yǎng)板（日本IWAKI公司），塑料離心管 （15mL，美國Corning公司）。

1.3 主要試劑

RPMI 1640液體培養(yǎng)基（美國Hyclone公司），新生牛牛血清 （50mL裝，購自杭州四季青生物工程材料有限公司），青霉素與鏈霉素（粉劑，華北制藥公司），MTT（噻唑藍(lán)，上海試劑一廠），二甲基亞砜（DMSO，F(xiàn)isher公司），胰酶細(xì)胞消化液 （100mL裝，碧云天公司）。

2 方法

2.1 配制不同血清濃度的培養(yǎng)基

在超凈工作臺中，分別配制含有3%、6%、9%血清和不含血清的RPMI－1640培養(yǎng)液（內(nèi)含青霉素和鏈霉素各100U／mL），其中不含血清的培養(yǎng)基為空白對照。按分組在T－25型塑料培養(yǎng)瓶中分別加入相應(yīng)血清含量的培養(yǎng)液，然后接種SGC－7901細(xì)胞。

2.2 細(xì)胞生長狀態(tài)的MTT法檢測

將人胃癌SGC7901細(xì)胞按2×103個細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，每種濃度設(shè)3列共24個復(fù)孔，每孔體積200μL，37℃，5%CO2孵育，不同血清濃度的單列培養(yǎng)孔在12h、24h、48h后，先用倒置相差顯微鏡觀察不同血清濃度條件下細(xì)胞的形態(tài)與生長狀況，再向每孔加入 MTT溶液（5mg／mL）20μL，繼續(xù)培養(yǎng)2.5h。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μL DMSO，振蕩10min后，利用酶標(biāo)儀，在選擇490nm波長下，測定各孔的光吸收值（OD值），記錄結(jié)果。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理，數(shù)據(jù)以（）表示，多組間比較采用雙因素方差分析，兩組間比較采用SNK法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 不同濃度血清培養(yǎng)后細(xì)胞的生長狀態(tài)

倒置顯微鏡下可見，培養(yǎng)12h、24h、48h的細(xì)胞，3%、6%和9%等血清條件下，SGC－7901細(xì)胞的生長未見明顯差異。貼壁細(xì)胞生長良好，胞漿飽滿，形態(tài)舒展。而無血清對照組細(xì)胞生長狀態(tài)較差，細(xì)胞呈圓形，體積小，有部分脫落。（見圖2－圖5）

3.2 MTT法檢測細(xì)胞生長狀態(tài)

SGC－7901細(xì)胞在含有3%、6%和9%新生牛血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)12h、24h和48h后，用MTT方法檢測到的反映各組活細(xì)胞數(shù)量（即細(xì)胞生長狀況）的OD值見表1。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，不同時間組之間的檢測結(jié)果差異無顯著性（F＝0.005，P＝0.995），兩組間比較結(jié)果，各組之間的差異無顯著性（P＞0.05）。不同血清濃度組之間，兩組比較結(jié)果：對照組與各血清濃度組之間差異均有顯著性（P＜0.05），但3%、6%、9%血清濃度組之間差異無顯著性（P＞0.05）（見表1），各組OD值與時間之間的關(guān)系見圖1。

圖1 四種不同血清條件的細(xì)胞在3個培養(yǎng)時間的生長狀態(tài)（OD值）

表1 不同濃度血清培養(yǎng)液培養(yǎng)SGC－7901細(xì)胞不同時間的吸光度值（OD值）（）

表1 不同濃度血清培養(yǎng)液培養(yǎng)SGC－7901細(xì)胞不同時間的吸光度值（OD值）（）

注：與對照組相比，＊P＜0.05，血清各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

時間0.423±0.0300.329±0.0150.271±0.0443%血清 0.480±0.046＊ 0.508±0.027＊ 0.516±0.060＊6%血清 0.488±0.023＊ 0.525±0.041＊ 0.534±0.043＊9%血清 0.531±0.048＊ 0.572±0.058＊ 0.616±0.06112h 24h 48h對照組組別＊

4 討論

新生牛血清或小牛血清是體外培養(yǎng)各類細(xì)胞時需要在RPMI－1640等人工培養(yǎng)基中添加的重要天然成分［3］，能為細(xì)胞提供包括多種生長因子在內(nèi)的低分子營養(yǎng)物，對于細(xì)胞的生長發(fā)育具有重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也再次驗(yàn)證了血清的作用。利用倒置顯微鏡觀察可見，在不含血清的對照組中，人胃癌SGC－7901細(xì)胞生長緩慢，形態(tài)呈圓形，體積小，出現(xiàn)部分脫落的現(xiàn)象。MTT法檢測結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞的吸光度值（OD值）明顯低于其余三個使用含血清培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)組的OD值。差異具有顯著性。說明在對照組的無血清條件下，SGC－7901細(xì)胞的生長與增殖活性較為低下。

然而，血清的成分復(fù)雜，不僅存在促進(jìn)細(xì)胞生長發(fā)育分裂增殖的生長因子，同時也存在有細(xì)胞生長的抑制因子或毒性因子，有些成分至今未完全搞清楚。細(xì)胞在含血清培養(yǎng)基中所呈現(xiàn)出來的生物學(xué)特性是復(fù)雜血清因子作用的結(jié)果［5］；同時，牛血清的價格越來越高，不斷增加著細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的成本。因此，近20多年來，國內(nèi)外多個實(shí)驗(yàn)室在探索細(xì)胞的低血清培養(yǎng)甚至無血清培養(yǎng)技術(shù)和方法，取得了一些重要進(jìn)展［6－7］。研究結(jié)果表明，有多種來自動物和人的正常細(xì)胞株以及腫瘤細(xì)胞株可以在低血清甚至無血清的培養(yǎng)基中正常地生長和增殖。當(dāng)然，無血清培養(yǎng)基中一般需要另外加入多種生長因子、激素，才能維持細(xì)胞的正常生長［8］。

小牛血清含量為9%的PRMI－1640培養(yǎng)基是我們實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)人胃癌SGC－7901細(xì)胞最常使用的細(xì)胞培養(yǎng)液，也用于人宮頸癌HeLa細(xì)胞、人肝癌SMMC－7721細(xì)胞和人結(jié)腸癌HCT－116細(xì)胞等多種腫瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)。之所以選擇9%的血清比例是考慮到添加血清配制完全培養(yǎng)基時比較方便。現(xiàn)在國內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室多使用500mL包裝的無菌液體培養(yǎng)基，在超凈工作臺內(nèi)按無菌操作將100mL包裝的小牛血清直接傾倒1／2即50mL左右至裝有500mL液體培養(yǎng)基包裝瓶內(nèi)，再加適量的雙抗溶液，蓋上瓶蓋，充分混合后即成9%血清的細(xì)胞培養(yǎng)基。這樣在培養(yǎng)基包裝瓶內(nèi)直接添加血清，操作簡單快捷，不使用其它容器，減少了污染的機(jī)會。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，人胃癌SGC－7901細(xì)胞在血清含量為6%和3%的RPMI－1640培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)與在9%血清含量培養(yǎng)基中的狀態(tài)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。表明3%血清含量培養(yǎng)基中的包括生長因子和激素在內(nèi)的各種營養(yǎng)物質(zhì)，可滿足SGC－7901細(xì)胞的生長發(fā)育和分裂增殖的需要，在此條件下，癌細(xì)胞自身所合成和分泌的多種生長因子也發(fā)揮了一定的作用。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在培養(yǎng)人胃癌SGC－7901細(xì)胞時，可應(yīng)用血清含量在3%～6%的低血清培養(yǎng)基，以減少小牛血清的用量，從而降低細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)成本，同時也可減少血清中有害成分的影響。

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