黃芪多糖對(duì)兔脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞體外增殖的影響

何文涓，張?zhí)m芳，袁志堅(jiān)，何曉升

(1.無(wú)錫衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校，江蘇 無(wú)錫 214028;2.杭州師范大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310036)

黃芪多糖(Astragalus Polysaccharides，APS)為中 藥黃芪的提取物，有研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的APS在體外能促進(jìn)人骨髓細(xì)胞中紅細(xì)胞系和粒細(xì)胞系祖細(xì)胞的生成，這種促進(jìn)作用在造血因子存在時(shí)，發(fā)揮的作用最大［1］。也有研究發(fā)現(xiàn)，短期低濃度APS能促進(jìn)誘導(dǎo)培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的代謝和蛋白質(zhì)的合成，有利于細(xì)胞的增殖和向成骨分化［2］。

骨髓干細(xì)胞量不多，取材也不便。最近一些研究表明人體脂肪、胎盤(pán)等組織中的干細(xì)胞，具有驚人的可塑性，和胚胎干細(xì)胞一樣，可以分化成各種各樣的組織細(xì)胞。且脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(ASCs)貯藏量豐富，取材方便，因此對(duì)ASCs的研究具有極大的實(shí)用價(jià)值。本研究對(duì)兔ASCs進(jìn)行培養(yǎng)，并觀察APS對(duì)兔ASCs體外增殖的作用。

1 材料

APS注射液(批號(hào):20090811)，成都新亨藥業(yè)有限公司;四甲基偶氮唑鹽(MTT)、碘化丙啶(PI)，美國(guó) Sigma公司;抗體 CD14，美國(guó) Caltag公司;CD29、CD44，美國(guó) Chemcon 公司;CD45，美國(guó) Antigenix公司;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清，美國(guó)Gibo公司。

3350型自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，美國(guó)Beckman公司;流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD公司。

家兔，雌雄不拘，體重約1 kg，清潔級(jí)，杭州師范大學(xué)動(dòng)物室提供。

2 方法

2.1 ASCs的來(lái)源和培養(yǎng)

家兔在利多卡因局部麻醉下，取出兩側(cè)腹溝處的脂肪組織，剪成顆粒狀，勻漿，用0.075%膠原酶Ⅰ消化，過(guò)300目篩網(wǎng)，4℃，1 200 r/min離心5 min，棄去上層脂肪和上清液，再用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌沉淀組織3次，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基稀釋，離心后取出沉淀組織。

將沉淀組織接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置37℃、5%CO2，飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，之后倒去原培養(yǎng)液，PBS洗兩次以去除未貼壁殘?jiān)?。然后加入?5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每周換液2次。當(dāng)瓶壁基本長(zhǎng)滿了原代培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

2.2 ASCs的表型鑒定

取第3代ASCs，用免疫細(xì)胞化學(xué)法對(duì)ASCs的表面標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè):加入抗體CD14、CD29、CD44和CD45，用流式細(xì)胞儀按說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞表面特異性抗原。

2.3 不同濃度APS對(duì)細(xì)胞的增殖作用

選取生長(zhǎng)良好的第3代細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化，制成細(xì)胞懸液，將濃度調(diào)至2×109/L，培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組僅加培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組依次加入含有不同濃度的APS的培養(yǎng)液(1.95 ～1 000 μg/mL)，培養(yǎng) 48 h，考察濃度對(duì)增殖的影響。

2.4 不同時(shí)間不同濃度APS對(duì)細(xì)胞的增殖作用

取2.3項(xiàng)下的培養(yǎng)24 h的細(xì)胞，隨機(jī)分為對(duì)照組和 ASP 25，50，100 μg/mL 組，對(duì)照組僅加培養(yǎng)液，ASP實(shí)驗(yàn)組分別加入相應(yīng)濃度APS的培養(yǎng)液，分別培養(yǎng)24，48，72 h，考察濃度和作用時(shí)間對(duì)增殖的影響。

2.5 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞的增殖

分別培養(yǎng)24，48和72 h之后，將濃度調(diào)為5×107/L，再分別將各孔細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔含細(xì)胞懸液100 μL，每孔加入5 mg/mL MTT 溶液20 μL，在37 ℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)后棄上清液。每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL，振蕩混勻，充分溶解 MTT結(jié)晶物后，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)在570 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以(x±s)表示，使用 SPSS10.0 軟件，用方差分析的方法比較組間差異。

3 結(jié)果

3.1 流式細(xì)胞儀表型分析結(jié)果

用第3代ASCs檢測(cè)顯示CD29和CD44為陽(yáng)性，而CD14和CD45為陰性。

3.2 不同濃度APS對(duì)細(xì)胞的增殖作用

結(jié)果見(jiàn)表1。兔ASCs與APS培養(yǎng)后，APS的濃度不同，對(duì)細(xì)胞增殖有不同的影響。低濃度APS對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)影響;而高濃度APS對(duì)細(xì)胞的增殖產(chǎn)生抑制作用。APS 濃度為 1.95 ～3.90 μg/mL 時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，無(wú)顯著差異(P＞0.05)，對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)促進(jìn)作用，倒置顯微鏡下見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞大致相同，形態(tài)正常;而APS濃度為7.80～1 000 μg/mL時(shí)，實(shí)驗(yàn)組分別與對(duì)照組比較，均有顯著差異(P＜0.01)，表現(xiàn)出明顯的抑制作用，倒置顯微鏡下見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞變小，但未見(jiàn)明顯壞死跡象，對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)正常。

3.3 不同時(shí)間不同濃度APS對(duì)細(xì)胞的增殖結(jié)果

結(jié)果見(jiàn)表2。APS濃度在25～100 μg/mL范圍內(nèi)，培養(yǎng)24 h后實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，均有顯著差異(P＜0.05)，對(duì)ASCs的增殖有明顯抑制作用。培養(yǎng)48和72 h后各組分別與對(duì)照組比較，均有極顯著差異(P＜0.01)，顯示對(duì)ASCs的增殖均有明顯抑制作用。所以，APS在一定濃度范圍內(nèi)，濃度對(duì)細(xì)胞增殖的影響不大，而與培養(yǎng)的時(shí)間有關(guān)，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)ASCs的抑制作用更加明顯。

4 討論

表1 48 h，不同濃度APS對(duì)ASCs增殖的影響(± s，n=4)Tab.1 The result of different concentrations of APS on proliferation of rabbit ASCs in vitro(± s，n=4)

表1 48 h，不同濃度APS對(duì)ASCs增殖的影響(± s，n=4)Tab.1 The result of different concentrations of APS on proliferation of rabbit ASCs in vitro(± s，n=4)

與對(duì)照組比較:1P＜0.01Compared with control group:1P ＜0.01

組別 濃度/(μg/mL) A值對(duì)照組 －1.057 ±0.037黃芪多糖組 1.95 0.938 ±0.092 3.90 0.995 ±0.040 7.80 0.966 ±0.0331 15.6 0.942 ±0.0301 31.2 0.910 ±0.0571 62.5 0.851 ±0.0391 125.0 0.680 ±0.0621 250.0 0.727 ±0.0421 500.0 0.439 ±0.0401 1 000.0 0.469 ±0.0291

APS對(duì)于細(xì)胞增殖的影響，目前爭(zhēng)論較多。張仲平等［1］在研究APS對(duì)人骨髓細(xì)胞的增殖作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，5 mg/L APS對(duì)人骨髓細(xì)胞粒單集落(CFUGM)和紅細(xì)胞集落(CFU-E)的生成有促進(jìn)作用，濃度過(guò)高或過(guò)低均無(wú)明顯作用;對(duì)爆式紅細(xì)胞集落(BFU-E)，則125 mg/L APS有顯著作用，低濃度的APS沒(méi)有作用。而許春姣等［2］在研究APS對(duì)犬骨基質(zhì)干細(xì)胞增殖作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組無(wú)論APS濃度高低(0.005 ～0.05，50 mg/mL)，與對(duì)照組相比，第1，3天細(xì)胞呈增殖趨勢(shì);第5天除0.005 mg/mL組外，細(xì)胞呈抑制趨勢(shì)。張朝陽(yáng)等［3］的研究結(jié)果表明，0.2 mg/mL的APS對(duì)牙周膜細(xì)胞的增殖具有明顯促進(jìn)作用(P＜0.05)，而高濃度的 APS(0.4 mg/mL)對(duì)牙周膜細(xì)胞的增殖具有明顯抑制作用(P＜0.05)。房信勝等［4］認(rèn)為，APS在低濃度時(shí)表現(xiàn)出一定的促進(jìn)細(xì)胞增殖作用，在高濃度時(shí)才表現(xiàn)出一定的抑制作用。

表2 不同時(shí)間APS對(duì)ASCs增殖的影響(± s，n=4)Tab.2 The result of different concentrations of APS on proliferation of rabbit ASCs at different time in vitro(± s，n=4)

表2 不同時(shí)間APS對(duì)ASCs增殖的影響(± s，n=4)Tab.2 The result of different concentrations of APS on proliferation of rabbit ASCs at different time in vitro(± s，n=4)

與對(duì)照組比較:1P ＜0.05，2P ＜0.01Compared with control group:1P ＜0.05，2P ＜0.01

組 別 濃度/(μg/mL)A 值24 h 48 h 72 h對(duì)照組 － 0.637 ±0.067 1.066 ±0.042 1.054 ±0.057黃芪多糖組 25 0.501 ±0.0391 0.717 ±0.0362 0.710 ±0.0372 50 0.495 ±0.0201 0.585 ±0.0152 0.576 ±0.0302 100 0.544 ±0.0301 0.544 ±0.0192 0.392 ±0.0402

本研究用MTT法測(cè)定不同濃度的APS對(duì)兔ASCs的增殖作用。48 h觀察細(xì)胞，所加 APS在1.95 ～3.90 μg/mL 時(shí)，對(duì) ASCs的增殖無(wú)促進(jìn)作用，也無(wú)抑制作用;而 APS在7.8～1 000 μg/mL時(shí)，對(duì)ASCs的增殖有明顯的抑制作用。而且，APS在25～100 μg/mL時(shí)，對(duì)細(xì)胞的增殖與細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)間有關(guān)，24 h時(shí)，APS對(duì)ASCs的增殖有抑制作用;48和72 h時(shí)，APS對(duì)ASCs增殖的抑制作用更明顯。

綜合以往報(bào)道，當(dāng)APS濃度達(dá)到200 mg/L左右及以上，對(duì)細(xì)胞的增殖產(chǎn)生的一般為抑制作用;當(dāng)APS濃度在100 mg/L左右及其以下，大多表現(xiàn)的是促進(jìn)作用。本研究表明，APS濃度即便在100 mg/L以下，表現(xiàn)出的是既無(wú)促進(jìn)作用，也無(wú)明顯抑制作用。在張仲平等［1］的研究中也有類似的“低濃度的APS沒(méi)有作用”的情形。

APS是黃芪的水提醇沉物，成分復(fù)雜，APS注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)主要考察多糖含量，但在已知的成分中除APS之外，還含黃芪甲苷、黃酮類以及氨基酸類等。黃芪產(chǎn)地的不同，采收時(shí)間的不同，選用部位的不同，都可能導(dǎo)致APS提取液中成分的不同和各成分含量的不同，因此，實(shí)驗(yàn)所用APS來(lái)源的不同，可能導(dǎo)致不同的結(jié)果。

本研究結(jié)果表明低濃度APS對(duì)ASCs的增殖無(wú)促進(jìn)作用，也無(wú)抑制作用，較高濃度的APS對(duì)ASCs的增殖有抑制作用。高濃度的APS對(duì)ASCs增殖的抑制作用與大多數(shù)報(bào)道相似，但低濃度APS對(duì)細(xì)胞的增殖也無(wú)促進(jìn)作用也無(wú)抑制作用，這種研究結(jié)果較為少見(jiàn)。具體原因有待進(jìn)一步研究。

［1］張仲平，洪介民.黃芪多糖對(duì)體外人骨髓造血祖細(xì)胞生成的影響［J］.中藥藥理與臨床，2000，16(1):16-17.

［2］許春姣，翦新春，郭 峰，等.黃芪多糖對(duì)犬骨基質(zhì)干細(xì)胞增殖及超微結(jié)構(gòu)的影響［J］.華西口腔醫(yī)學(xué)雜志，2007，25(5):432-436.

［3］張朝陽(yáng)，孔祥麗，陳思秀，等.黃芪多糖對(duì)牙周細(xì)胞增殖與結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)影響［J］.華西口腔醫(yī)學(xué)雜志，2010，28(5):556-559.

［4］房信勝，穆象山，周紅英，等.黃芪皂苷和黃芪多糖對(duì)大鼠腎臟系膜膜細(xì)胞增殖的影響［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2008，19(6):1448-1449.