響應(yīng)面法優(yōu)化白囊耙齒菌中腺苷的提取工藝

張 娜，周 衛(wèi)，王文溪，尹秀菊，滕利榮，林 鳳

(吉林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130012)

白囊耙齒菌(Irpex lacteus.Fr)是多孔菌科木材腐生真菌［1］，主要分布于長白山林區(qū)和黑龍江、河北、山西、甘肅、江西、福建、云南、西藏等地［2］。多將其液體發(fā)酵產(chǎn)物作為研究對象，臨床上主要用于慢性腎小球腎炎的治療［3］。目前，對白囊耙齒菌中有效成分的研究主要集中在多糖［4］及糖蛋白［3］。腺苷(Adenosine)是核苷的一種，在生物化學(xué)上扮演著重要角色。腺苷在炎癥反應(yīng)中具有重要作用，對中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的功能具有抑制作用［5-6］。在臨床上，腺苷多用于心肌保護(hù)和心臟功能的修復(fù)［7-9］。

響應(yīng)面分析法(Response surface analysis methodology，RSM)能將多因子實(shí)驗(yàn)中各個(gè)因子與響應(yīng)值之間的復(fù)雜關(guān)系，以多元二次回歸方程表示，簡單、快速地對實(shí)驗(yàn)進(jìn)行全面的研究，并得到最優(yōu)化參數(shù)［10-11］。

在一些標(biāo)題的翻譯中，譯者還別出心裁地從目的語出發(fā)，重新創(chuàng)造標(biāo)題，這些標(biāo)題常常是原文中心思想的高度概括或是原文主要內(nèi)容的別樣顯示。這樣的例子很多，比如：

本文采用RSM對白囊耙齒菌中腺苷提取工藝進(jìn)行了研究，通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合模型，研究提取溫度、提取時(shí)間和液料比對腺苷得率的影響以及各因素之間的相互作用，確定最優(yōu)的提取工藝，為白囊耙齒菌的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定了一定理論基礎(chǔ)。

1 材料

白囊耙齒菌(吉林省通化市林海藥業(yè)提供);白囊耙齒菌菌絲體(由本實(shí)驗(yàn)室液體發(fā)酵獲得);腺苷對照品(Sigma公司，純度99%);乙腈和甲醇均為色譜純;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

他們常常運(yùn)用一些絕妙而驚人的點(diǎn)子，對照片進(jìn)行巧妙加工，接受后現(xiàn)代主義發(fā)起的挑戰(zhàn)。與辛蒂·舍曼(Cindy Sherman)和大衛(wèi)·拉切貝爾(David LaChapelle)一樣，桑迪·斯各格蘭德是“裝置攝影”藝術(shù)的杰出探索者之一。

白囊耙齒菌菌絲體干粉1 g，加水浸提。10 000 r/min 離心10 min，分離上清液，0.22 μm 微孔濾膜過濾，濾液用于腺苷含量測定。

2 方法

2.1 樣品預(yù)處理

采用高效液相色譜法測定樣品中腺苷的含量［12］。流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)-甲醇(85∶15)。色譜柱為C18柱，流速1 mL/min，檢測波長260 nm，柱溫35℃，進(jìn)樣量20 μL。按外標(biāo)法，以峰面積計(jì)算腺苷含量。腺苷得率=(提前得到的腺苷質(zhì)量/菌絲體干粉質(zhì)量)×100%。

2.2 菌絲體中腺苷的提取方法

Eppendorf 5810R型高速冷凍離心機(jī)(德國);島津LC-10TA高效液相色譜儀(日本)。

2.3 腺苷得率的測定方法

采用液體深層發(fā)酵的方法獲得白囊耙齒菌發(fā)酵液，經(jīng)抽濾得到菌絲體，并用水洗滌2次。菌絲體真空冷凍干燥，用多功能粉碎機(jī)粉碎后過60目篩，制成白囊耙齒菌菌絲體干粉備用。

2.4 單因素試驗(yàn)優(yōu)化腺苷提取條件

3.1.3 液料比對腺苷得率的影響 白囊耙齒菌菌絲體干粉分別按液料比 5∶1，10∶1，20∶1，25∶1，30∶1，40∶1，50∶1，60∶1，提取溫度 40 ℃，提取 2.5 h。然后取上清液測定腺苷得率，結(jié)果如圖3所示。從圖3可看出，腺苷得率隨液料比的增大呈逐漸上升趨勢，液料比到達(dá)40∶1時(shí)，腺苷得率已趨于穩(wěn)定，從節(jié)約資源方面考慮，選取液料比40∶1為最適值進(jìn)行下一步優(yōu)化。

采用SAS RSREG程序?qū)Ρ?中數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析，多元二次回歸方程為:

2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化腺苷提取條件

縱觀現(xiàn)階段我國市場經(jīng)濟(jì)的發(fā)展過程中，眾多企業(yè)紛紛關(guān)注到了財(cái)務(wù)管理的重要，紛紛從公司的治理結(jié)構(gòu)來透視企業(yè)財(cái)務(wù)管理情況。財(cái)務(wù)管理作為企業(yè)日常管理的重要組成部分，對于企業(yè)的治理結(jié)構(gòu)的優(yōu)化以及未來的發(fā)展都至關(guān)重要。當(dāng)前隨著企業(yè)走上市的創(chuàng)新途徑，在復(fù)雜競爭環(huán)境中的發(fā)展壓力也越來越大。要想排除企業(yè)的一切風(fēng)險(xiǎn)要素，提升企業(yè)的市場競爭力，還需要積極從公司的治理結(jié)構(gòu)和財(cái)務(wù)管理角度進(jìn)行深入分析。進(jìn)一步明確新時(shí)期現(xiàn)代財(cái)務(wù)管理的目標(biāo)。以此為企業(yè)的改革和發(fā)展提供積極導(dǎo)向作用。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行三因素三水平的Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，見表1。采用響應(yīng)面分析法研究三個(gè)隨機(jī)因子(提取溫度、提取時(shí)間和液料比)對響應(yīng)值(腺苷得率)的影響。用SAS V8.0的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)工具箱對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合，對回歸方程和關(guān)鍵因素進(jìn)行方差分析，并得到最優(yōu)的腺苷提取條件。應(yīng)用matlab 7.0根據(jù)響應(yīng)方程繪制響應(yīng)曲面圖和等高線圖直觀分析圖。

表1 中心組合設(shè)計(jì)的因素與水平表Tab.1 Factors and levels of RSM analysis

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素試驗(yàn)優(yōu)化腺苷提取條件

3.1.1 提取溫度對腺苷得率的影響 白囊耙齒菌菌絲體干粉按液料比20∶1，提取溫度分別為30，40，50，60，70 ℃，提取 3.5 h。然后取上清液測定腺苷得率，結(jié)果如圖1所示。從圖1中可以看出，溫度為40℃時(shí)腺苷得率最高。提取溫度低于40℃時(shí)腺苷得率隨溫度的升高而增加，高于40℃時(shí)腺苷得率反而下降，這是由于在一定范圍內(nèi)升高溫度，有助于腺苷從細(xì)胞中溢出，但當(dāng)溫度過高時(shí)，腺苷的分解效應(yīng)會(huì)逐漸取代腺苷的溢出效應(yīng)，故腺苷得率反而下降。

李景星在《史記評議》中對此大加贊賞，他說“天地日月，難以形容；圣如孔子，亦難以形容。孟子稱為圣之時(shí)，已是創(chuàng)論。而史公世家，更稱之為至，尤為定評。自是之后，遂永遠(yuǎn)不能易矣?！盵2](P141)可見，司馬遷對孔子推崇備至。司馬遷把孔子放到“至圣”的崇高地位，反映了他評價(jià)歷史人物的獨(dú)到眼光，也反映了他對孔子的深刻認(rèn)同。司馬遷首先稱孔子為“至圣”，把孔子的地位大大提高了，在《史記》中司馬遷又是怎樣表現(xiàn)他對“至圣”孔子的關(guān)注呢？

圖1 提取溫度對腺苷得率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on the yield of adenosine

3.1.2 提取時(shí)間對腺苷得率的影響 白囊耙齒菌菌絲體干粉按液料比20∶1，提取溫度40℃，分別提取 0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 h。然后取上清液測定腺苷得率，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，提取時(shí)間為2.5 h時(shí)腺苷得率最大，在2.5 h前，隨提取時(shí)間的延長呈逐漸上升趨勢;提取時(shí)間到達(dá)2.5 h后，腺苷得率反而有下降趨勢。這是由于在一定范圍內(nèi)，延長提取時(shí)間，腺苷可以更充分的從菌絲體中溶出，當(dāng)提取時(shí)間繼續(xù)增加時(shí)，腺苷的分解將降低腺苷得率。

圖2 提取時(shí)間對腺苷得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the yield of adenosine

按照2.2項(xiàng)下方法提取白囊耙齒菌中的腺苷，采用單因素試驗(yàn)分別考察提取溫度、提取時(shí)間、液料比對腺苷得率的影響。

圖3 液料比對腺苷得率的影響Fig.3 Effect of solvent/solid on the yield of adenosine

3.2 響應(yīng)面法優(yōu)化腺苷提取工藝

根據(jù)單因素試驗(yàn)得到的優(yōu)化結(jié)果，以X1=(Z1－40)/10，X2=(Z2－2.5)/1，X3=(Z3－20)/20 為自變量，以腺苷得率Y為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平的Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素和水平的設(shè)計(jì)見表1，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果如表2所示，采用多元二次回歸方法對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)分析，并采用偏導(dǎo)方法求解多元二次回歸方程的極值，得到最佳的腺苷提取條件。

表2 Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Box-Behnken experiments design and the results of experiments

大學(xué)生心理亞健康問題初探…………………………………………………………………………………………李汝湘（1.53）

回歸模型的相關(guān)系數(shù)R2為0.998 7，調(diào)整R2為0.996 4，說明回歸方程高度顯著，模型的擬合度很好，響應(yīng)值的99.64%來自于所選變量。由表3的分析結(jié)果可以看出，模型回歸P為0.000 1，說明模型回歸顯著可靠，使用該方程代替真實(shí)的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行分析是可行的，能夠?qū)憫?yīng)值(腺苷得率)進(jìn)行預(yù)測。

由表3可以看出，一次項(xiàng)p(0.000 1)為高度顯著項(xiàng)，說明所選因素與響應(yīng)值之間存在顯著的線性關(guān)系;同時(shí)，平方項(xiàng)p(0.000 1)為高度顯著項(xiàng)，說明所選因素對響應(yīng)值的影響是高度卷曲的，由圖4可以直觀的看出響應(yīng)曲面的高度卷曲。所考察因素中X2，X3，X1X1，X3X3均為影響高度顯著項(xiàng)，X1X2為影響顯著項(xiàng)，說明實(shí)驗(yàn)因素與響應(yīng)值之間不只是簡單的線性關(guān)系，二次項(xiàng)和交互項(xiàng)對響應(yīng)值的影響很大，并且方程的擬合是充分的。因此，可以利用該回歸方程確定白囊耙齒菌中腺苷的最佳提取工藝。

圖4是根據(jù)響應(yīng)方程所繪制的響應(yīng)曲面和等高線圖，它們能直觀地描述兩個(gè)因素之間的交互作用對響應(yīng)值的影響。由圖4A可看出，其等高線呈橢圓形，橢圓形的軸線與X1和X2坐標(biāo)軸存在一個(gè)角度，說明X1(提取溫度)和X2(提取時(shí)間)存在明顯的交互作用。X1X2項(xiàng)(提取溫度與提取時(shí)間間的交互項(xiàng))的P(0.019 4)為影響顯著項(xiàng)。當(dāng)X2處于一定值時(shí)，X1對腺苷得率隨的影響呈拋物線變化;當(dāng)X1處于低水平時(shí)，即提取溫度較低時(shí)，增加提取時(shí)間能明顯提高腺苷的得率，而當(dāng)X1處于高水平時(shí)，即提取溫度較高時(shí)，增加提取時(shí)間腺苷得率反而降低，表明X1和X2間有高度顯著的交互作用。X1的最適值為正值，而X2的最適值為負(fù)值，這兩個(gè)因素互相抑制，與回歸方程中X1X2項(xiàng)系數(shù)為負(fù)號(hào)相符。圖4B顯示X3(液料比)對響應(yīng)值的影響曲線比較陡峭，同時(shí)X3由低水平變化到高水平過程中等高線的數(shù)目明顯多于X1(提取溫度)，說明液料比對腺苷得率的影響高度顯著。圖4B中等高線呈橢圓形，但是橢圓軸線與X1坐標(biāo)幾乎平行，說明X1和X3之間的交互作用不顯著。這兩個(gè)因素的最適值均為正，存在互相促進(jìn)作用，這與回歸方程中X1X3項(xiàng)系數(shù)為正號(hào)相符。從圖4C中也可得出相似的結(jié)論，液料比對腺苷得率的影響高度顯著(p為0.000 1);而X2和X3之間的交互作用不顯著;X2和X3之間存在相互促進(jìn)的作用。

采用SAS工具箱計(jì)算腺苷超聲波法最優(yōu)提取條件的編碼值為:X1= － 0.057，X2=0.922，X3=0.522。根據(jù)編碼值與非編碼值的轉(zhuǎn)換式解得Z1=39.4 ℃、Z2=3.4 h 和 Z3=50.4∶1。因此，白囊耙齒菌中腺苷的最佳提取工藝為提取溫度39.4℃，提取時(shí)間3.4 h，料水比50.4∶1。由回歸方程預(yù)測腺苷得率的理論值可達(dá)到1.11%。

由于點(diǎn)A滿足兩個(gè)條件，即∠CAD=45°，AB=3，滿足雙軌跡的基本條件，由∠CAD=45°，C與D是兩個(gè)定點(diǎn)，即點(diǎn)A是定角軌跡；由AB=3，點(diǎn)A到CD的距離為3，點(diǎn)A就是定向軌跡，構(gòu)造兩個(gè)軌跡，其交點(diǎn)就是點(diǎn)A；作AB⊥CD，垂足為B.

表3 回歸分析結(jié)果Tab.3 Statistical results of regression analysis

圖4 響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.4 Responsive surfaces and contours

3.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

采用模型預(yù)測的最佳提取條件進(jìn)行腺苷提取的驗(yàn)證試驗(yàn)，三次平行試驗(yàn)得到腺苷得率的平均值為1.09%，與理論預(yù)測值(1.11%)的相對誤差為1.80%，可見預(yù)測值與試驗(yàn)值吻合很好，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié)論

在本工藝中，提取時(shí)間和液料比的一次項(xiàng)和平方項(xiàng)對腺苷得率的影響高度顯著，提取溫度和提取時(shí)間的交互項(xiàng)對腺苷得率影響顯著。最優(yōu)提取工藝為:提取溫度 39.4 ℃，提取時(shí)間 3.4 h，料水比50.4∶1，3 次驗(yàn)證試驗(yàn)腺苷平均得率為 1.09%。采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化白囊耙齒菌腺苷的水提工藝，準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)，為白囊耙齒菌的研究開發(fā)奠定了一定理論基礎(chǔ)。但研究發(fā)現(xiàn)腺苷提取液中還含有大量的多糖、蛋白質(zhì)、甘露醇等其他物質(zhì)，對于腺苷提取液的進(jìn)一步開發(fā)利用尚需要深

入研究。

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