創(chuàng)造酶切位點(diǎn)與PCR-RFLP原理在基因多態(tài)檢測中的應(yīng)用探討

孫東杰，岳馨培，師 樂，孫成林，王 威

(鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與職業(yè)病學(xué)教研室 河南鄭州 450001)

單核苷酸多態(tài)性(SNP)指染色體基因組水平上單個(gè)核苷酸變異。SNP檢測中，聚合酶鏈反應(yīng)－限制性片段長度多態(tài)性(PCR－RFLP)技術(shù)具有操作簡單、特異性高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，特別適用于已知突變位點(diǎn)檢測［1］。對無合適內(nèi)切酶或內(nèi)切酶價(jià)格昂貴時(shí)，可引入錯(cuò)配堿基創(chuàng)造酶切位點(diǎn)(Create restriction site，CRS)方法設(shè)計(jì)引物，然后進(jìn)行PCR-RFLP檢測［2］。

該文總結(jié)了應(yīng)用CRS方法結(jié)合PCR－RFLP原理對多個(gè)SNP檢測方法的研究結(jié)果［3－6］，探討了該方法在基因多態(tài)檢測中的注意事項(xiàng)，為相關(guān)研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 試劑:2×PCR mix(MBI公司)，限制性內(nèi)切酶MSPI(MBI公司)，瓊脂糖(BBI公司)，引物由上海 Sangon公司合成。儀器:9600型PCR儀(PE公司)，微型電泳槽(Pharmacia Biotech，EPS1000)，Gel Doc 2000凝膠成像儀(Bio－RAD公司)。PCR產(chǎn)物測序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 方法 CRS－PCR－RFLP是根據(jù)引物堿基錯(cuò)配技術(shù)設(shè)計(jì)的檢測單堿基突變的方法。其原理是根據(jù)單堿基突變位點(diǎn)的堿基替代情況設(shè)計(jì)引物，其中一條引物根據(jù)突變位點(diǎn)鄰近序列設(shè)計(jì)，引入錯(cuò)配堿基，使得引物3’端和單堿基突變的一種突變型在PCR擴(kuò)增后形成一個(gè)酶切位點(diǎn)，然后應(yīng)用相應(yīng)內(nèi)切酶酶切鑒定。

1.3 序列查找及引物設(shè)計(jì) 在NCBI網(wǎng)站查找基因序列和SNP信息，結(jié)合文獻(xiàn)確定多態(tài)堿基信息，利用Primer Premier5.0軟件分析內(nèi)切酶識(shí)別情況，設(shè)計(jì)引入錯(cuò)配堿基的引物并確定創(chuàng)造的酶切位點(diǎn)。

1.4 PCR擴(kuò)增及酶切鑒定 取50 ng的基因組DNA、每個(gè)引物 0.2 μmol/L、1 × PCRmix、ddH2O 組成25 μl反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)條件為首先94℃預(yù)變性5 min，然后94℃變性30 s，根據(jù)引物Tm值取(55～60)℃退火20 s，72℃延伸20 s，共30個(gè)循環(huán)后72℃延伸10 min。PCR后，取PCR產(chǎn)物10 μl，加入5 u內(nèi)切酶和2 μl 10×酶切緩沖液和ddH2O組成20 μl反應(yīng)體系，37℃水浴2～16 h后，電泳后凝膠成像觀察。

2 結(jié)果

2.1 序列搜索與多態(tài)位點(diǎn)確定 查找NCBI的SNP數(shù)據(jù)庫，收集 MGMT、ADH2、MTHFR和 PON2基因全序列及相關(guān)多態(tài)位點(diǎn)。各基因多態(tài)位點(diǎn)情況見表1。

2.2 序列分析與引物設(shè)計(jì) 經(jīng)序列分析可知可識(shí)別原多態(tài)序列的內(nèi)切酶及其價(jià)格情況，對價(jià)格較貴者進(jìn)行錯(cuò)配分析。通過堿基錯(cuò)配將多態(tài)位點(diǎn)附近堿基進(jìn)行替換，直至形成可被較廉價(jià)內(nèi)切酶識(shí)別的序列。然后根據(jù)錯(cuò)配位點(diǎn)情況確定上下游引物的位置與長度(設(shè)計(jì)引物、選擇的內(nèi)切酶及其識(shí)別堿基情況見表1)。其中MGMT基因多態(tài)rs2308321和rs2308327因位點(diǎn)接近而設(shè)計(jì)一對特殊引物，兩引物分別進(jìn)行堿基錯(cuò)配，PCR后分別采用不同內(nèi)切酶進(jìn)行多態(tài)鑒定。

2.3 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 通過PCR-RFLP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果與預(yù)期一致。不同基因型PCR產(chǎn)物測序結(jié)果亦符合預(yù)期。

表1 基因多態(tài)位點(diǎn)信息與引物設(shè)計(jì)情況

3 討論

應(yīng)用CRS-PCR-RFLP進(jìn)行SNP檢測，拓寬了PCRRFLP的適用范圍，在實(shí)際應(yīng)用中具有很大的靈活性，具有較好的應(yīng)用前景，特別適合于基層單位開展已知位點(diǎn)SNP的檢測。綜合考慮有關(guān)檢測中出現(xiàn)的一些問題，CRS-PCR-RFLP技術(shù)的應(yīng)用需要考慮以下問題。

3.1 SNP情況 SNP一般情況需全面掌握，主要包括基因名稱、染色體位置、rs號(hào)、堿基序列及多態(tài)堿基替代(氨基酸替代)等。

3.2 內(nèi)切酶情況 內(nèi)切酶識(shí)別序列和價(jià)格因素要考慮，部分識(shí)別非回文序列的內(nèi)切酶識(shí)別序列可能在2種以上，盡量篩選價(jià)格便宜者以利于推廣。

3.3 擴(kuò)增產(chǎn)物情況 擴(kuò)增產(chǎn)物是否存在其他SNP位點(diǎn)、酶切位點(diǎn)個(gè)數(shù)及其切開后片段長度需考慮。切開后各個(gè)條帶之間需具備可分辨性，一般兩片段差異需超過長片段的10%，通常擴(kuò)增產(chǎn)物長度為100～200 bp?？紤]用瓊脂糖凝膠電泳分辨，價(jià)格便宜，易于操作。必要時(shí)可考慮聚丙烯酰胺凝膠電泳。

3.4 引物設(shè)計(jì)的原理和技巧 創(chuàng)造酶切位點(diǎn)方法可用于內(nèi)切酶價(jià)格昂貴或者無內(nèi)切酶識(shí)別的情況，另外可通過錯(cuò)配堿基消除酶切位點(diǎn)、發(fā)夾結(jié)構(gòu)和引物二聚體，或者與序列中其他位點(diǎn)的無關(guān)錯(cuò)配情況。

［1］王威，夏昭林.人類基因組單核苷酸多態(tài)性研究與疾病三級(jí)預(yù)防體系［J］.國外醫(yī)學(xué)衛(wèi)生學(xué)分冊，2006，33(6):321-325.

［2］張忠彬，朱人，夏昭林.應(yīng)用CRS-RFLP技術(shù)檢測hOGG1c.326位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性［J］.中國工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2004，17(5):293-295.

［3］王威，繆文彬，仇玉蘭，等.雙創(chuàng)造酶切位點(diǎn)PCR-RFLP檢測MGMT基因多態(tài)性的應(yīng)用［J］.衛(wèi)生研究，2008，37(1):5-8.

［4］焦?jié)崳跬?，劉靜，等.應(yīng)用創(chuàng)造酶切位點(diǎn)PCR-RFLP檢測乙醇脫氫酶2基因多態(tài)性［J］.衛(wèi)生研究，2009，38(1):4-6.

［5］王威，楊永利，周舫，等.創(chuàng)造酶切位點(diǎn)PCR-RFLP檢測MTHFR(rs2274976)基因多態(tài)性［J］.衛(wèi)生研究，2011，40(2):162-163.

［6］王威，姚武，周舫，等.創(chuàng)造酶切位點(diǎn) PCR-RFLP檢測 PON2(rs12026)基因多態(tài)性［J］.河南醫(yī)學(xué)研究，2010，19(1):5-8.