STAT2，STAT3，IL12RB2，JAK2基因與強(qiáng)直性脊柱炎患病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)研究

張玉榮 張建佚 周 林 宋玉國 張吉林

朱小泉1 楊 帆1，2 黃慈波1 霍正浩2 楊 澤1

強(qiáng)直性脊柱炎屬于風(fēng)濕病范疇，累及多個(gè)器官、多個(gè)系統(tǒng)，病情復(fù)雜，致殘率極高，嚴(yán)重影響患者的身心健康，并給個(gè)人、家庭和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)。強(qiáng)直性脊柱炎常見于(16～30)歲的青年人，40歲以后首次發(fā)病者少見，約占3.3%。該病的發(fā)病率國內(nèi)為0.3% ～0.4%，國外總體人群發(fā)病率為0.1% ～0.2%［1］。因而強(qiáng)直性脊柱炎并不是一種少見的疾病，且以年輕男性多見，必須引起高度重視。對于強(qiáng)直性脊柱炎動物模型的研究，證明了遺傳因素和環(huán)境因素共同參與了強(qiáng)直性脊柱炎的發(fā)病。遺傳學(xué)的相關(guān)研究又表明多種炎癥因子與強(qiáng)直性脊柱炎的發(fā)病密切相關(guān)，例如HLA27，TNF2α，MMP3，IL21等［2］。從免疫因子信號傳導(dǎo)通路中尋找強(qiáng)直性脊柱炎的致病原因已經(jīng)成為一種重要的研究方法。STAT2，STAT3，IL12RB2，JAK2基因存在于細(xì)胞因子IL-12通路上，IL-12通路是細(xì)胞免疫的重要因子，能調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞免疫應(yīng)答的平衡。

因此本文從細(xì)胞因子IL-12通路上選取STAT2，STAT3，IL12RB2，JAK2這4個(gè)基因，并進(jìn)一步選取這些基因中的6個(gè)位點(diǎn)，從遺傳學(xué)角度展開研究，進(jìn)行這些位點(diǎn)與強(qiáng)直性脊柱炎的關(guān)聯(lián)分析，以增加大家對強(qiáng)直性脊柱炎的了解。

1.材料與方法

1.1 材料 吉林漢族人群的48名患者來自北華大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)中心，所有病例均經(jīng)病理組織學(xué)確證。55名正常對照為來自吉林地區(qū)的無血緣關(guān)系的健康正常人群。所有研究對象采集靜脈血5ml，并簽署有知情同意。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng)條件 應(yīng)用HRM小擴(kuò)增子法進(jìn)行基因分型時(shí)，雜合型主要依據(jù)熔解曲線形狀，而純合型則是依據(jù)Tm值的不同，所以擴(kuò)增片段要盡量小，這樣有助于擴(kuò)大純合型樣本間Tm值的差異。引物、探針序列采用Primer Premier 5.0軟件及Light Scanner Primer Design software完成，高溫內(nèi)參與低溫內(nèi)參依據(jù)文獻(xiàn)合成。各SNP基因分型所用方法、引物序列和退火溫度、退火時(shí)間和延伸時(shí)間(見表1)。其中SNPrs10758669、SNPrs744166是采用PCR-RFLP方法，所用限制性內(nèi)切酶分別為:BsaJI、AluI;各酶的酶切情況是338bp→288bp和50bp，247bp→218bp和29bp;其余的SNPs采用HRM-小擴(kuò)增子法。限制性內(nèi)切酶BsaJI、AluI的酶切溫度分別為55℃、37℃，BsaJI酶切時(shí)間為3～4小時(shí)，AluI的酶切時(shí)間大約(7～8)小時(shí)。

表1 6個(gè)SNPs PCR擴(kuò)增條件

1.2.2 產(chǎn)物測序 PCR產(chǎn)物送上海生工技術(shù)有限公司及北京天一輝遠(yuǎn)公司進(jìn)行測序，以驗(yàn)證分型的準(zhǔn)確性，做好質(zhì)量控制，只列舉部分SNPs測序結(jié)果說明。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 對照人群Hardy-Weinberg平衡采用(卡方擬和優(yōu)度檢驗(yàn)。相對風(fēng)險(xiǎn)用比數(shù)比(odd ratio，OR)值及其95%可信區(qū)間(95%CI)來評價(jià)。用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算等位基因及基因型頻率，各組間基因型及等位基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn)差異的顯著性水平(檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05)。用SPSS 16.0軟件建立數(shù)據(jù)庫完成相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析。采用SHEsis進(jìn)行單倍型分析。應(yīng)用MDR進(jìn)行基因交互作用分析。

2.結(jié)果

2.1 STAT2基因(rs2066808，C;rs2066807，G)，STAT3 基因(rs744166，C)，IL12RB2 基因(rs3790567，A;rs3790568，A)和JAK2基因(rs10758669，A)的風(fēng)險(xiǎn)等位基因及其基因型頻率 以Hardy-Weinberg平衡法檢驗(yàn)病例組與正常對照組的基因型頻率的分布，除了rs2066808(P＜0.05)，其他均具有群體代表性(P＞0.05)。STAT2基因(rs2066807，G)，STAT3基因(rs744166，C)，IL12RB2 基因(rs3790567，A;vrs3790568，A)和JAK2基因(rs10758669，A)與強(qiáng)直性脊柱炎關(guān)聯(lián)分析顯示各基因的風(fēng)險(xiǎn)等位基因和基因型頻率在病例組和對照組間的分布差異無顯著性(P＞0.05)。

圖1 SNP rs3790567 CG型測序圖

圖2 SNP rs3790567 GA型測序圖

圖3 SNP rs3790567 AA型測序圖

表2 6個(gè)SNPs的風(fēng)險(xiǎn)等位基因和基因型頻率

表3 單倍型分析結(jié)果

2.2 單倍型分析

2.2.1 IL12RB2基因上rs3790567，rs3790568的單倍型分析 IL12RB2基因上rs3790567，rs3790568單倍型分析的總r2為4.090，P-exact值為0.130。由表3可以看出P值均大于0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2.2 采用 MDR分析 STAT2基因(rs2066807，G)，STAT3基因(rs744166，C)，IL12RB2 基因(rs3790567，A;rs3790568，A)和JAK2基因(rs10758669，A)的5個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的交互作用 MDR分析的最佳模型包含了 rs2066807，rs3790567，rs744166，rs107586669這4個(gè)位點(diǎn)(如圖4所示)，圖中空白表明該基因型空缺。模型的P＜0.0001，交叉驗(yàn)證一致性為10/10，檢驗(yàn)樣本的準(zhǔn)確度為 0.7032，結(jié)果提示STAT2，STAT3，IL12RB2和JAK2基因之間可能存在基因-基因交互作用。樹狀圖顯示rs744166和rs107586669作用比較強(qiáng)烈。節(jié)點(diǎn)圖顯示，只有STAT3(rs744166，C)與其他三個(gè)基因都具有協(xié)同作用，而其他三個(gè)基因都各有與其拮抗的基因。其中STAT3與JAK2基因之間距離更短，協(xié)同百分?jǐn)?shù)最高，有最強(qiáng)的協(xié)同作用。

圖4 STAT2(rs2066807)，STAT3(rs744166)，IL12RB2(rs3780567)和JAK2(rs10758669)基因交互作用

圖5 STAT2(rs2066807，G)，STAT3(rs744166，C)，IL12RB2(rs3790567，A)和 JAK2(rs10758669，A)交互作用樹狀圖、節(jié)點(diǎn)圖

3.討論

強(qiáng)直性脊柱炎是一種自身免疫性疾病，其病因未明。強(qiáng)直性脊柱炎的發(fā)病與多種因素相關(guān)，其中基因遺傳是非常重要的因素，因此本文對細(xì)胞因子IL12通路上STAT2基因(rs2066808，C;rs2066807，G)，STAT3 基因(rs744166，C)，IL12RB2基因(rs3790567，A;rs3790568，A)和 JAK2 基因(rs10758669，A)展開研究，研究其與AS的關(guān)聯(lián)性，及這些基因之間的交互作用。

IL-12是最強(qiáng)的促炎癥因子之一，它由35kDa和40kDa的兩條鏈構(gòu)成，其中35kDa的鏈編碼IL12A，40kDa的鏈編碼IL12B［3］。IL12來自于外周血T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞，能夠直接刺激干擾素γ(IFNγ)，腫瘤壞死因子(TNFα)以及IL12的產(chǎn)生，提高自然殺傷細(xì)胞溶解酶的活性，促進(jìn)有活性的自然殺傷細(xì)胞和T細(xì)胞(CD4+和CD8+)擴(kuò)增。通過這些功能，IL12促進(jìn)產(chǎn)生最為常見的Ⅰ型T細(xì)胞反應(yīng)。通過IFNγ，IL12能夠抑制血管再生［4］。J M Pe＇ron曾經(jīng)臨床實(shí)驗(yàn)性的使用IL12用來治療腫瘤，試驗(yàn)的結(jié)果顯示在一些病例中IL12可以使腫瘤衰退。STAT3作為JAK2的靶蛋白，正常情況下位于細(xì)胞漿內(nèi)。當(dāng)JA K2被激活后，信號經(jīng)JAK2/STAT3通路傳導(dǎo)，使STAT3磷酸化而活化，即p2STAT3表達(dá)增加，然后轉(zhuǎn)入核內(nèi)，與靶基因啟動子結(jié)合，誘導(dǎo)基因表達(dá)，轉(zhuǎn)錄合成效應(yīng)底物［4］。Bromberg認(rèn)為STAT3在細(xì)胞的增值和生存方面扮演了重要角色［5］。有文獻(xiàn)報(bào)道，心肌缺血缺氧及再灌注等可以作為應(yīng)激原刺激多種細(xì)胞因子產(chǎn)生，激活JAK2，啟動JAK2/STAT3信號通路，介導(dǎo)心肌保護(hù)作用［6～8］。然而與AS相關(guān)的報(bào)道，不是很多。

總之，AS是一個(gè)微效基因參與發(fā)病機(jī)制的多基因病。文中rs2066808位點(diǎn)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)不平衡，估計(jì)是樣本太少，不具有群體代表意義。STAT2基因(rs2066807，G)，STAT3 基因(rs744166，C)，IL12RB2 基因(rs3790567，A;rs3790568，A)和JAK2基因(rs10758669，A)關(guān)聯(lián)分析顯示各基因的風(fēng)險(xiǎn)等位基因和基因型頻率在病例組和對照組間的分布差異無顯著性(P＞0.05)。樹狀圖顯示 rs744166和rs107586669作用比較強(qiáng)烈。對于中國人群的AS研究仍然需要在一個(gè)大的樣本中進(jìn)一步驗(yàn)證。

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