STAT4基因與吉林人群強(qiáng)直性脊柱炎關(guān)聯(lián)研究

楊 帆 張建佚 周 林 宋玉國(guó) 張吉林 朱小泉 張玉榮 黃慈波 霍正浩 楊 澤

強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)屬類風(fēng)濕因子陰性慢性進(jìn)行性炎性疾病，主要侵犯骶髂關(guān)節(jié)及中軸骨骼，也可累及髖關(guān)節(jié)、外周關(guān)節(jié)及韌帶附著點(diǎn)等，可引起椎間盤纖維環(huán)及其附近韌帶鈣化和骨性強(qiáng)直。此病炎癥高度活動(dòng)和低度活動(dòng)相交替，好發(fā)于青少年，發(fā)病者多為10～40歲的男性。黃種人中發(fā)病率為0.2% ～0.5%，男性患者多于女性患者，男女比例為10∶1［1］。強(qiáng)直性脊柱炎的病因及發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前普遍認(rèn)為是遺傳因素與環(huán)境因素相互作用的結(jié)果。

STAT4屬轉(zhuǎn)錄活化因子(signal transducer and activator of transcription，STAT)家族，主要被 IL－12激活，在 Th1/Th2的分化調(diào)控及因其失調(diào)引發(fā)的各種炎癥性疾病中有重要的作用。STAT4是Th1細(xì)胞發(fā)育必不可少的，若STAT4缺失可減輕T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。在實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)腦脊髓炎、關(guān)節(jié)炎、大腸炎、心肌炎及非肥胖型糖尿病小鼠模型實(shí)驗(yàn)中，與野生型小鼠相比，STAT4缺陷小鼠的炎癥反應(yīng)更輕，且發(fā)病率更低［2，3］。

我們希望通過(guò)觀察STAT4基因上rs7574865、rs8179673、rs10181656和rs7582694在吉林強(qiáng)直性脊柱炎患者及正常對(duì)照人群之間的分布頻率，以探討 rs7574865、rs8179673、rs7582694和rs10181656與吉林人群強(qiáng)直性脊柱炎患病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)聯(lián)。

1.材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 研究對(duì)象 強(qiáng)直性脊柱炎患者來(lái)自北華大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)中心，其中男性40名，女性16名，共56名，男女性別比約2∶1，年齡范圍(14～44)歲，平均年齡24歲;56名對(duì)照血液標(biāo)本來(lái)自吉林地區(qū)的無(wú)血緣關(guān)系的健康正常人群，男性43名，女性13名，年齡范圍(39～72)歲，平均年齡46歲。所有病例均符合1985年修訂的紐約診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］。所有研究對(duì)象均對(duì)該檢測(cè)項(xiàng)目知情同意，并提供外周血用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑 全基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自Bio Chain公司;Taq DNA聚合酶和dNTP購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司;LC－Green Plus飽和熒光染料購(gòu)自美國(guó)Idaho公司;限制性內(nèi)切酶購(gòu)自MBI Fermentas公司。引物由上海生工生物技術(shù)開發(fā)有限公司合成;基因測(cè)序由華大基因測(cè)序部完成。

1.1.3 主要儀器 PCR擴(kuò)增儀為美國(guó)MJ公司的PTC－225型PCR儀;高分辨熔解曲線(HRM)基因突變/基因分型檢測(cè)系統(tǒng)為美國(guó)Idaho公司Lightscanner TMHR－I 96;DNA定量分析儀為德國(guó)Eppendorf公司的Biophotometer蛋白/核酸比色儀。凝膠成像系統(tǒng)為美國(guó)Bio－Rad公司的Gel DOC－2000成像系統(tǒng)。離心機(jī)為美國(guó)Beckman公司的Allegra TM 21R型離心機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取及定量 取EDTA抗凝的受試者外周血0.5ml，用全基因組DNA提取試劑盒抽提DNA，通過(guò)蛋白/核酸比色儀對(duì)提取的基因組DNA進(jìn)行濃度和純度的分析。根據(jù)測(cè)定結(jié)果將樣本DNA稀釋至20μg/μl的工作液置于4℃冰箱。

1.2.2 基因分型方法 采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)－高分辨率熔解曲線(PCR－HRM)及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)－限制性位點(diǎn)多態(tài)性(PCR－RFLP)技術(shù)，并結(jié)合測(cè)序驗(yàn)證分型結(jié)果。rs7574865、rs8179673和rs7582694位點(diǎn)用PCR－HRM技術(shù)進(jìn)行分型，rs10181656位點(diǎn)用傳統(tǒng)的 PCR－RFLP技術(shù)進(jìn)行分型。

1.2.3 引物合成 從Genebank中查得這4個(gè)SNPs位點(diǎn)上下游序列，通過(guò)Oligo 6.0和Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物。rs7574865引物序列為:F:5'－AATTACATGAGTGTGTATGCAGTAAA －3'，R:5'－CCCTGAAATTCCACTGAAATAAGAT －3';rs8179673引物序列為:F:5'－CTGCCATAGAAGTCTTTGAAGC－3'，R:5'－GATGATGATGTGTATGGTGGTT－3';rs10181656引物序列為:F:5'－ACTGTGATAGATAACTAGCTGGAAT－3'，R:5'－AAAGCAGGGAACGAGGAAGAT－3';rs7582694引物序列為:F:5'－CCTTCCAATGGTTTCTCATTTCAA －3'，R:5'－ AAAGAACAAGCAAACATGCATAG －3';低溫內(nèi)參:F:5'－TTAAATTATAAAATATTTATAATATTAATTATATATATATAAATATAATA － 3'，R:5'－ TATTATATTTATATATATATAATTAATATTATAAATATTTTATAATTTAA－3';高溫內(nèi)參:F:5'－GCGCGGCCGGCACTGACCCGAGACTCTGAGCGGCTGCTGGAGGTGCGGAAGCGGAGGGGCGGG －3'，R:5'－CCCGCCCCTCCGCTTCCGCACCTCCAGCAGCCGCTCAGAGTCTCGGGTCAGTGCCGGCCGCGC－3'。寡核苷酸內(nèi)參末端用C3封閉，以阻止延伸反應(yīng)。

1.2.4 PCR反應(yīng) PCR反應(yīng)體系均為10μl。HRM用PCR 體系含:模板 DNA 1μl，10 × PCR Buffer 1μl，dNTP(10mmol/L)0.2μl，Taq DNA 聚合酶(5U/μl)0.2μl，上下游引物各(10pmol/μl)0.1μl，上下游高低溫內(nèi)參各 0.05μl，1 × LC－Green Plus飽和熒光染料 1μl及雙蒸水 6.2μl。RFLP 用PCR 體系包含:模板 DNA 1μl，10 × PCR Buffer 1μl，dNTP(10mmol/L)0.2μl，Taq DNA 聚合酶(5U/μl)0.2μl，上下游引物各0.1μl及雙蒸水7.4μl。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5min后進(jìn)入主循環(huán)，95℃變性30s，退火，72℃延伸(rs7574865退火溫度為61℃，退火時(shí)間為20s，延伸時(shí)間為7s;rs8179673退火溫度為 52℃，退火時(shí)間為 25s，延伸時(shí)間為 12s;rs10181656退火溫度為61℃，退火時(shí)間為30s，延伸時(shí)間為30s;rs7582694退火溫度為53℃，退火時(shí)間為25s，延伸時(shí)間為12s)，總共35個(gè)循環(huán)，完成后72℃延伸7min。之后用HRM技術(shù)分型的樣本需進(jìn)行變性和復(fù)性處理，程序?yàn)?95℃ 30s，25℃ 2min，94℃ 30s，24℃ 4min。rs7574865 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)56bp，rs8179673 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)104bp，rs10181656 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)101bp，rs7582694 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)120bp。

1.2.5 HRM檢測(cè) 將PCR產(chǎn)物移入HRM專用96孔板內(nèi)，在Light Scanner TMHR－I 96上進(jìn)行HRM分析:從45℃開始，以0.3℃/s的斜率采集熔解曲線，到98℃結(jié)束，用Light Scanner Call IT軟件對(duì)采集后的曲線進(jìn)行分析，判定基因型。

1.2.6 RFLP分型 PCR產(chǎn)物經(jīng)8%PAGE電泳后，凝膠成像觀察PCR擴(kuò)增結(jié)果，符合要求后，用DdeⅠ酶進(jìn)行酶切，時(shí)間控制在7～8小時(shí)。酶切完成后8%PAGE電泳，凝膠成像觀察分型結(jié)果。酶切體系共 10μl，其中包括:Buffer 1μl，DdeⅠ酶0.3μl，雙蒸水5.7μl和 PCR 產(chǎn)物3μl。

1.2.7 測(cè)序驗(yàn)證 根據(jù)HRM分析的不同曲線及酶切結(jié)果確定不同的基因型。從所得的不同基因型的個(gè)體中分別隨機(jī)抽取5例樣本進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序樣本重新進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)序用PCR引物與PCR反應(yīng)所用引物相同。PCR反應(yīng)體系 50μl，包含:DNA 模板 5μl，10 × PCR Buffer 5μl，10 mmol/L dNTP 1μl，Taq DNA 聚合酶(5U/μl)1μl，上下游引物(10pmol/μl)各0.5μl，去離子水補(bǔ)充總體積至50 μl。PCR反應(yīng)條件與第一次PCR條件相同。PCR產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)觀察合格后送華大基因測(cè)序部進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用Hardy－Weinberg平衡檢驗(yàn)研究樣本的群體代表性。用比數(shù)比(OR)值及其95%可信區(qū)間(95%CI)來(lái)評(píng)價(jià)相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)。組間基因型頻率及等位基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2.結(jié)果

2.1 STAT4基因分型結(jié)果 PCR產(chǎn)物經(jīng)HRM分析后，可根據(jù)樣本的熔解曲線差異，將所有樣本分為3個(gè)組。3組之間的熔解曲線差異非常明顯，見圖1。測(cè)序結(jié)果進(jìn)行網(wǎng)上BLAST比對(duì)，序列完全一致。rs10181656PCR產(chǎn)物經(jīng)DedⅠ酶切后，GG型為兩個(gè)條帶，分別長(zhǎng)66bp和35bp;GC型為三個(gè)條帶，分別長(zhǎng) 101bp、66bp和 35bp;CC型為一個(gè)條帶，長(zhǎng)101bp，見圖2。HRM及RFLP分型結(jié)果與測(cè)序的結(jié)果完全吻合，準(zhǔn)確率為100%，測(cè)序圖見圖2。

2.2 STAT4基因型和等位基因頻率在病例組及正常對(duì)照中的分布 用SPSS 16.0軟件對(duì)STAT4基因上4個(gè)SNP位點(diǎn)rs7574865、rs8179673、rs10181656及rs7582694在病例和對(duì)照中基因型和等位基因頻率分布進(jìn)行分析后，發(fā)現(xiàn)無(wú)顯著性差異(P ＞0.05)，見表1。

2.3 STAT4基因單倍型頻率和風(fēng)險(xiǎn)分析 用SHEsis在線軟件將這4個(gè)SNPs組成的單倍型進(jìn)行頻率和風(fēng)險(xiǎn)分析后，結(jié)果只有rs8179673和rs10181656組成的單倍型TG在病例和對(duì)照中分布具有顯著性差異(P=0.045;OR=3.126，95%CI:0.973～10.044)，見表2。

表1 吉林人群中STAT4基因型和等位基因頻率分布比較

表2 STAT4基因單倍型頻率和風(fēng)險(xiǎn)分析

續(xù)表2

3.討論

STAT4基因定位于2q32.2－32.3，全長(zhǎng)121kb，含24個(gè)外顯子，編碼序列(CDS)區(qū)由2247個(gè)連續(xù)核苷酸組成，編成748個(gè)氨基酸。STAT4具有STAT家族其他成員相似的蛋白結(jié)構(gòu)，均由C端的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)，近C端的Src同源結(jié)構(gòu)域及所有STAT共有的701氨基酸上的酪氨酸位點(diǎn)，中部的DNA結(jié)合域及N端保守區(qū)等幾部分構(gòu)成。但STAT4的表達(dá)譜不及其他STAT蛋白廣泛，主要分布在淋巴和髓系組織中。STAT4主要由 IL －12 激活，但也可被 IFN － α/β，IL －23 激活［5，6］。IL－12與受體(IL－12R)特異性結(jié)合，IL－12R發(fā)生二聚化，激活JAK，繼而受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)鏈特定區(qū)域酪氨酸位點(diǎn)磷酸化，招募STAT4單體，JAK對(duì)STAT4單體產(chǎn)生激活作用?；罨蟮腟TAT4形成同源二聚體，并穿越核膜識(shí)別DNA上的特定靶序列，啟動(dòng)特異的基因轉(zhuǎn)錄，從而增加IFN－γ的產(chǎn)生［7］。

Zervou等發(fā)現(xiàn)rs7574865突變等位基因T，一個(gè)之前曾報(bào)道與許多自身免疫性疾病有關(guān)的等位基因，在銀屑病患者中要比在對(duì)照中更普遍，因此推論rs7574865多態(tài)性與希臘銀屑病的發(fā)生有關(guān)［8］。Ji JD等進(jìn)行的 meta分析說(shuō)明rs7574865與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡顯著關(guān)聯(lián)［9］。另外許多研究已報(bào)道STAT4是與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡及Ⅰ型糖尿病關(guān)聯(lián)的易感基因［10～13］。

為探討STAT4這4個(gè)SNPs與吉林人群AS發(fā)生的關(guān)系，我們采用病例 －對(duì)照設(shè)計(jì)，應(yīng)用 PCR－HRM技術(shù)檢測(cè)rs7574865、rs8179673和 rs7582694，用 PCR －RFLP技術(shù)檢測(cè)了rs10181656多態(tài)性在吉林AS病例組與正常對(duì)照組之間的分布情況。在本研究中，我們對(duì)病例組和正常對(duì)照組的基因型頻率進(jìn)行了Hardy－Weinberg平衡檢驗(yàn)(P＞0.05)，表明我們所選擇的群體具有很好的代表性。我們用基因片段測(cè)序技術(shù)對(duì)PCR－HRM和PCR－RFLP技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證和質(zhì)量控制，準(zhǔn)確率100%，基因分型結(jié)果穩(wěn)定可靠。

本研究結(jié)果顯示，rs7574865、rs8179673、rs7582694和rs10181656位點(diǎn)的各種基因型頻率及各等位基因頻率在吉林AS病例組與正常對(duì)照組之間的分布均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。本研究結(jié)果表明 rs7574865、rs8179673、rs7582694和rs10181656可能與吉林人群AS的發(fā)生無(wú)關(guān)聯(lián)。但經(jīng)多位點(diǎn)單倍型頻率分布分析后發(fā)現(xiàn)，rs8179673和rs10181656位點(diǎn)組成的單倍型TG在病例和對(duì)照中分布具有顯著性差異(P=0.045;OR=3.126，95%CI:0.973 －10.044)。因此，我們可以推斷在rs8179673和rs10181656之間的連鎖區(qū)域內(nèi)或其周圍序列中可能存在與AS真正關(guān)聯(lián)的變異。

限于本研究所涉及的樣本數(shù)量有限，本次研究未發(fā)現(xiàn)STAT4基因與吉林人群AS發(fā)生之間的關(guān)聯(lián)性，但本研究結(jié)果尚不能確定STAT4基因與吉林人群AS發(fā)生之間的確切關(guān)系。

對(duì)于STAT4基因與吉林人群AS發(fā)生相關(guān)性的最終結(jié)論，還需在其他群體及更大樣本中進(jìn)一步探索，以便為AS的病因?qū)W研究、診斷及治療提供理論依據(jù)。

附圖

圖1 HRM分析rs7582694，灰色為GC型，紅色為GG型，為CC型

圖2 rs10181656 位點(diǎn) PCR 產(chǎn)物酶切電泳圖，1、3、5、7、8、9、10、11為 GC 型(101bp、66bp和35bp)，12為 GG 型(66bp和35bp)，2、4、6為 CC 型(101bp)

1 Laval S H，Timms A，Edwards S，Bradbury L，Brophy S，Milicic A，Rubin L，Siminovitch K A，Week D E，Calin A，Wordsworth B P，Brown M A.Whole-genome screening in ankylosing spondylitis:evidence of non-MHC genetic-susceptibility loci［J］.Am J Hum Genet，2001，68(4):918－926.

2 Finnegan A，Grusby MJ，Kaplan CD，et al.IL －4 and IL －12 regulate proteoglycan-induced arthritis through Stat-dependent mechanisms［J］.J Immunol，2002，169(6):3345 －3352.

3 Yang Z，Chen M，Ellett JD，et al.Autoimmune diabetes is blocked in Stat4-deficient mice［J］.J Autoimmun，2004，22(3):191 －200.

4 Goie The H S，Steven M M，van der Linden S M，Cats A，Evaluation of diagnostic criteria for ankylosing spondylitis:A comparison of the rome，new york and modified new york criteria in patients with a positive clinical history screening test for ankylosing spondylitis［J］.Br J Rheumatol，1985，24(3):242 －249

5 Nguyen KB，Wafford WT，Salomon R，et al.Critical role for STAT4 activation by typeⅠinterferons in the interferon-gamma response to viral infection［J］.Science，2002，297(5589):2063 －2066.

6 Watford WT，Hissong BD，Bream JH，et al.Signaling by IL －12 and IL－ 23 and the immunoregulatory roles of STAT4［J］.Immunol Rev，2004，202(2):139 －156.

7 Wafford WT，Morignehi M，Morinobu A，et al.The biology of IL －12:coordinating innate and adaptive immune responses［J］.Cytokine ＆Growth Factor Rev，2003，14(5):316 －368.

8 Zervou MI，Goulielmos GN，Castro-Giner F et al.STAT4 gene polymorphism is associated with psoriasis in the genetically homogeneous population of Crete，Greece［J］.Hum Immunol.70(9):738 －741.

9 Ji JD，Lee WJ，Kong KA et al.Association of STAT4 polymorphism with rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus:a meta-analysis［J］.Mol Biol Rep.2010，37(1):141 －7.

10 Liang YL，Wu H，Li PQ et al.Signal transducer and activator of transcription 4 gene polymorphisms associated with rheumatoid arthritis in Northwestern Chinese Han population［J］.Life Sci，2011，1，89(5 －6):171－5.

11 SU Yin，ZHAO Yi，LIU Xu 等.Variation in STAT4 is associated with systemic lupus erythematosus in Chinese Northern Han population［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志(英文版)，2010，123(22):3173 －3177.

12 李萍，欒海霞，胡朝軍等.IRF7/KIAA154和STAT4基因多態(tài)性與中國(guó)漢族人群系統(tǒng)性紅斑狼瘡的相關(guān)性［J］.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2010，33(7):611 －617.

13 Zervou MI，Mamoulakis D，Panierakis C et al.STAT4:a risk factor for type1 diabetes?［J］Human Immunology，2008，69(10):647 －650.