針刺對高脂大鼠主動脈脂聯(lián)素受體1和2蛋白表達的影響*

袁愛紅，蔡 輝

（南京軍區(qū)南京總醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，南京 210002）

脂聯(lián)素（APN）是脂肪組織來源的脂肪因子，在人和小鼠的血漿中以不同的低聚物形式存在。臨床研究[1]提示，低APN在2型糖尿病、冠狀動脈疾病和高血壓中的發(fā)病機制，實驗研究[2]也提示APN在胰島素抵抗、高血壓和心血管疾病的發(fā)展中發(fā)揮保護作用。APN與脂聯(lián)素受體（AdipoR）結(jié)合后激發(fā)各種下游信號，發(fā)揮生理作用。高脂飲食誘導(dǎo)的高脂血癥大鼠會出現(xiàn)主動脈內(nèi)皮的損傷及功能的紊亂[3]。為了探討高脂飲食對機體主動脈APN信號的影響以及針刺對其的作用，筆者用酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）法檢測血清APN，用Western Blotting法檢測主動脈AdipoR1/2含量，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

實驗動物為剛斷乳的SD雄性大鼠26只，體質(zhì)量（60±9）g，由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院動物實驗中心提供，實驗動物使用許可證號SYXK（蘇）2003-0032。

1.1 實驗方法 所有SD大鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，根據(jù)體質(zhì)量編號，采用隨機數(shù)字表法隨機分為高脂飼料組（17只）和普通飼料組（簡稱對照組，9只），喂養(yǎng)12周后，空腹過夜，球后靜脈取血3 mL，室溫靜置1h后，3000r/min離心5min，分離血清置-20℃冰箱保存，測血脂4項、一氧化氮（NO）和髓過氧化物酶（MPO）。然后根據(jù)體質(zhì)量編號，采用隨機數(shù)字表法將高脂飼料組大鼠隨機分為模型組（8只）和針刺組（9只），干預(yù)4周。

針刺組：選取后三里、內(nèi)庭、心俞三穴，進針后，每穴快速行針1 min，后三里和內(nèi)庭接通G6805Ⅱ型電針儀連續(xù)波15 min，強度1 mA，頻率10 Hz。每次選取一側(cè)肢體，兩側(cè)輪流，周一到周六治療，周日休息，連續(xù)4周。實驗期間所有大鼠均自由攝食飲水。

1.2 觀察指標(biāo)和方法 實驗結(jié)束后，禁食24 h，于次日上午8時，用20%氯胺酮，以10 mL/kg劑量麻醉后，剪開胸腹腔，暴露心臟，心臟取血3 mL，血液處理同上。每組隨機選取3只，于冰盤中分離主動脈，置液氮中保存待測AdipoR1/2蛋白。甘油三酯（TG）用脂蛋白酶-甘油磷酸氧化酶-過氧化物醇-4-氨基比林和酚法（TPO-PAP），總膽固醇（TC）用膽固醇氧化酶-過氧化物酶-4-氨基比林和酚法（CHOD-PAP），高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）用選擇性沉淀法，NO用硝酸還原法，MPO用鄰連茴香胺法，APN用ELISA法（美國R＆D公司），主動脈AdipoR1和AdipoR2蛋白檢測用Western Blotting法（Santa Cruz公司），用CD31顯示血管內(nèi)皮細胞，光鏡觀察主動脈血管的形態(tài)學(xué)變化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 干預(yù)前高脂與對照比較用獨立樣本t檢驗，多組資料組間比較用單因素方差分析，方差齊性用LSD，方差不齊用Games-Howell。統(tǒng)計軟件用 SPSS 15.0，統(tǒng)計變量以均數(shù)±標(biāo)準差（±s）表示。

2 結(jié)果

2.1 高脂飲食對SD大鼠血脂、NO和MPO的影響

見表1。高脂組大鼠TG和TC明顯高于對照組，HDL-C和LDL-C高于對照但無統(tǒng)計學(xué)差異。高脂大鼠MPO明顯高于對照組，NO明顯低于對照組。

表1 干預(yù)前高脂和對照組血脂、NO和MPO水平（±s）Tab.1 The serum levels of blood fat,NO and MPO in hyperlipaemia and control group before treatment（±s）

表1 干預(yù)前高脂和對照組血脂、NO和MPO水平（±s）Tab.1 The serum levels of blood fat,NO and MPO in hyperlipaemia and control group before treatment（±s）

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

組別對照組高脂組n917 TG(mmol/L)0.93±0.151.82±0.36*HDL-C(mmol/L)1.06±0.171.61±0.82組別對照組高脂組n917 LDL-C(mmol/L)0.20±0.050.41±0.38 TC(mmol/L)1.83±0.233.39±0.93**NO(μmol/L)23.08±3.4213.07±3.14**MPO(U/L)42.28±7.6552.23±6.45**

2.2 針刺對高脂大鼠APN和AdipoR蛋白的影響見表2、圖1。模型組血清APN明顯低于對照組，針刺組明顯高于模型組。模型組主動脈AdipoR1蛋白明顯低于對照組，針刺組高于模型組低于對照組；模型組主動脈AdipoR2蛋白明顯低于對照組，針刺組高于模型組，低于對照組。

表2 干預(yù)后各組APN、AdipoR表達情況（±s）Tab.2 The serum APN and protein contents of AdipoR of each group after treatment（±s）

表2 干預(yù)后各組APN、AdipoR表達情況（±s）Tab.2 The serum APN and protein contents of AdipoR of each group after treatment（±s）

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

組別對照組模型組針刺組APN（g/L）97.3218±3.1684▲▲77.7054±9.5204**100.3864±3.4116▲▲AdipoR1蛋白0.5006±0.0622▲▲0.0746±0.0258**0.2839±0.2269 AdipoR2蛋白0.5908±0.0677▲▲0.1778±0.0384**0.3588±0.0543*▲

2.3 針刺對高脂大鼠主動脈形態(tài)學(xué)的影響 光鏡顯示：模型組大鼠內(nèi)皮組織大部脫落，平滑肌明顯增生，排列紊亂，細胞肥大；針刺組內(nèi)皮基本完好，偶有脫落，平滑肌細胞增殖不明顯，排列規(guī)則；對照組大鼠內(nèi)皮光滑平整，平滑肌組織分布均勻。見圖2-4。

3 討論

脂聯(lián)素也稱作ACRP30和AdipoQ，在人和小鼠的血漿中以三聚體、六聚體和高分子量形式存在[4]。脂肪組織能夠正性調(diào)節(jié)許多脂肪細胞因子，但是體脂含量，特別是內(nèi)臟脂肪負性調(diào)節(jié)血漿中脂聯(lián)素的水平。脂聯(lián)素對血管生成和內(nèi)皮功能產(chǎn)生有力的影響。研究顯示[5]，脂聯(lián)素能夠減少載脂蛋白E（ApoE）缺乏小鼠的動脈粥樣硬化，刺激內(nèi)皮細胞遷移和分化為毛細管樣結(jié)構(gòu)，阻止內(nèi)皮細胞凋亡；腺病毒介導(dǎo)脂聯(lián)素的傳遞增加了野生鼠和脂聯(lián)素基因剔除小鼠內(nèi)皮祖細胞的動員，用脂聯(lián)素孵育人周圍血單核細胞增加了內(nèi)皮祖細胞數(shù)量；脂聯(lián)素堆積在受傷動脈的內(nèi)皮和內(nèi)皮下膜，抑制內(nèi)皮炎癥反應(yīng)和平滑肌細胞增殖。氧化應(yīng)激等會造成脂聯(lián)素的減少，脂聯(lián)素減少又會加劇氧化應(yīng)激狀態(tài)。主動脈內(nèi)皮細胞表達AdipoR1和AdipoR2，優(yōu)先表達AdipoR1。研究發(fā)現(xiàn)[6]，AdipoR1和AdipoR2在同組織同影響條件下表達有不同。疾病過程中AdipoR含量上調(diào)或下調(diào)及其活化狀態(tài)改變均可以引起細胞對APN的敏感性變化，從而影響細胞的代謝及功能，成為促進疾病發(fā)生與發(fā)展的重要機制之一。

本實驗顯示，高脂飲食造成的高脂血癥大鼠血清MPO明顯升高、NO明顯降低，脂聯(lián)素水平顯著降低，主動脈脂聯(lián)素受體1和2顯著減少，分析認為，進食大量高脂飲食后，體內(nèi)脂質(zhì)過氧化增多，產(chǎn)生了過多的氧自由基，造成機體氧化應(yīng)激增加，損傷了脂聯(lián)素信號的傳遞，降低了脂聯(lián)素對血管的保護作用，主動脈出現(xiàn)損傷；主動脈損傷后產(chǎn)生多種炎癥因子，進一步影響脂聯(lián)素信號的傳遞，使機體氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)加劇，造成惡性循環(huán)。本實驗中，針刺組大鼠血清MPO明顯下降，NO和脂聯(lián)素水平明顯上升，主動脈脂聯(lián)素受體2明顯增加，脂聯(lián)素受體1有上升趨勢，說明針刺能夠增加高脂飲食機體主動脈脂聯(lián)素信號的表達，發(fā)揮對主動脈的保護作用。根據(jù)本實驗結(jié)果，筆者認為針刺上調(diào)脂聯(lián)素信號包括了對脂聯(lián)素和脂聯(lián)素受體兩方面的調(diào)節(jié)，針刺對主動脈脂聯(lián)素信號的調(diào)節(jié)中脂聯(lián)素受體2發(fā)揮了主要介導(dǎo)作用。最近，Hug等[7]分離了第三種表達在血管內(nèi)皮和平滑肌的脂聯(lián)素受體T-cadherin，其是否在針刺對血管的保護中發(fā)揮作用有待進一步研究。

本研究顯示，喂高脂飲食12周后，高脂飲食組大鼠HDL-C升高，與文獻記載相符，這可能與飲食中的脂肪刺激肌肉脂蛋白酯酶活性，增加轉(zhuǎn)運率，減少HDL-C的主要轉(zhuǎn)運蛋白載脂蛋白A1（ApoA1）的分解率，飽和脂肪酸的高攝入可能增加了HDL-C。

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