補(bǔ)腎調(diào)沖方對(duì)去卵巢大鼠性激素水平及下丘腦雌激素受體α、雌激素受體βmRNA表達(dá)的影響*

杜永紅，李沛霖，韓 冰

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津 300150）

補(bǔ)腎調(diào)沖方對(duì)去卵巢大鼠性激素水平及下丘腦雌激素受體α、雌激素受體βmRNA表達(dá)的影響*

杜永紅，李沛霖，韓 冰

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津 300150）

[目的]探討補(bǔ)腎調(diào)沖方對(duì)去卵巢大鼠血清性激素水平及下丘腦雌激素受體α（ERα）、雌激素受體β（ERβ）mRNA表達(dá)的影響。[方法]以假手術(shù)組為對(duì)照，將去卵巢大鼠隨機(jī)分為去卵巢空白組，補(bǔ)腎調(diào)沖方高、中、低劑量組，已烯雌酚組。采用放射免疫分析法測(cè)定血清雌二醇（E2）、促卵泡生成激素（FSH）、促黃體生成激素（LH）水平，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶聯(lián)反應(yīng)（RT－PCR）檢測(cè)下丘腦ERα、ERβmRNA表達(dá)。[結(jié)果]去卵巢大鼠血清FSH、LH水平升高，E2及下丘腦ERα、ERβmRNA水平降低，補(bǔ)腎調(diào)沖方大鼠血清E2有升高趨勢(shì)，F(xiàn)SH有降低趨勢(shì)，補(bǔ)腎調(diào)沖方能降低去卵巢大鼠血清LH水平，升高下丘腦ERα、βmRNA的表達(dá)。[結(jié)論]補(bǔ)腎調(diào)沖方在改善去卵巢大鼠性激素水平同時(shí)，可能通過(guò)影響ERα、ERβmRNA的表達(dá)，提高ER的生物效應(yīng)，從而降低更年期綜合征的發(fā)生。

補(bǔ)腎調(diào)沖方；去卵巢大鼠；性激素；下丘腦；雌激素受體

更年期綜合征是婦科常見(jiàn)病之一，是指婦女在絕經(jīng)前后由于卵巢功能逐漸衰退、雌激素水平下降，出現(xiàn)以植物神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂為主伴有神經(jīng)心理癥狀的一組證候群。近年來(lái)該病有發(fā)病年齡提早、發(fā)病率上升的趨勢(shì)，因而越來(lái)越受到人們重視。本實(shí)驗(yàn)選用去卵巢大鼠模型模擬更年期改變，從血清性激素水平及下丘腦雌激素受體（ER）方面探討補(bǔ)腎調(diào)沖方的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境 雌性Wistar大鼠，體質(zhì)量（200±10）g(由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證編號(hào)：2002-031)。飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，室溫為（20±2）℃，自由攝食和飲水。在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中分籠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 補(bǔ)腎調(diào)沖方，組成：菟絲子15 g，黃精 15g，熟地黃 15g，肉蓯蓉 10g，當(dāng)歸 10g，川芎 6g，由天津安舜藥房提供。水煎后濃縮定容，相當(dāng)于原生藥2.4 kg/L的藥物，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。已烯雌酚?天津力生制藥廠生產(chǎn)（批號(hào)：0501001）。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑 雌二醇（E2）放免試劑盒，批號(hào):RG 66-04,購(gòu)自天津九鼎公司；促卵泡生成激素（FSH）、促黃體生成激素（LH）放免試劑盒，批號(hào)：051220，購(gòu)自北京北方生物技術(shù)研究所。ImProm-Ⅱ反轉(zhuǎn)錄酶、三磷酸脫氧核糖核苷酸（dNTP）、隨機(jī)引物pd(N)6購(gòu)自美國(guó)Promega公司；異硫氰酸胍、焦碳酸二乙酯（DEPC）、β-巰基乙醇等購(gòu)自美國(guó)Simga公司；Taq DNA聚合酶、三羥甲基氨基甲烷（Tris堿）、水飽和酚、超純水和DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker等購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；其他生化試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器 γ放射免疫計(jì)數(shù)儀16探頭CAPRIA-16，美國(guó)；紫外分光光度計(jì)（B ioPhotomete r），德國(guó)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（3K18），美國(guó)；聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增儀（TH-48a），杭州大和熱磁有限公司；-80℃超低溫冰箱，美國(guó)；多功能電泳儀，北京六一儀器廠；自動(dòng)凝膠圖像分析系統(tǒng)，上海天能科技公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物模型的建立及分組 在適應(yīng)環(huán)境5 d后，10%水合氯醛，按3mL/kg腹腔注射，將大鼠麻醉成功后，行雙側(cè)卵巢切除手術(shù)。假手術(shù)組按同法操作，僅摘除卵巢周?chē)糠种尽?/p>

動(dòng)物去卵巢1周后連續(xù)5 d作陰道細(xì)胞學(xué)涂片，有動(dòng)情周期變化者為去卵巢不徹底，予以剔除。假手術(shù)組大鼠陰道脫落細(xì)胞涂片動(dòng)情周期正常。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為補(bǔ)腎調(diào)沖方高、中、低劑量組，已烯雌酚組，去卵巢空白組，假手術(shù)組。

2.2 給藥方法 補(bǔ)腎調(diào)沖方高、中、低劑量組分別按38.16、19.08、9.54 g/kg體質(zhì)量（相當(dāng)于臨床等效劑量4、2、1倍）灌胃。已烯雌酚組:研碎，加水配成混懸液，按0.1mg/kg體質(zhì)量灌胃。去卵巢空白組：以生理鹽水l0mL/kg體質(zhì)量灌胃。1次/d，連續(xù)60 d。

3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

3.1 血清E2、FSH、LH放免測(cè)定及方法 末次給藥24 h后股動(dòng)脈取血。血液靜置40min后，3 500 r/min離心15min，分離血清，置于-20℃低溫冰箱保存待測(cè)。采用放射免疫分析法測(cè)定，按試劑盒操作。

3.2 下丘腦雌激素受體α（ERα）、雌激素受體β（ERβ）mRNA檢測(cè)及方法。

3.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取材方法 末次給藥24 h后斷頭處死大鼠，立即取出全腦并在冰浴上分離下丘腦，將組織置于-70℃液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

3.2.2 檢測(cè)基因的引物設(shè)計(jì)與合成 按照引物設(shè)計(jì)原則及所需實(shí)驗(yàn)條件，根據(jù)Genbank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中的大鼠ERα、ERβ和看家基因G3PDH基因序列設(shè)計(jì)引物，ERα 引物序列：5′-AATTCTGACAATCGACGCCAG-3′，5′-GTGCTTCAACATTCTCCCTCCTC-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度 345 bp；ERβ：5′-TTCCCGGCAGCACCAGTAACC-3′，5′-TCCCTCTTTGCGTTTGGACTA-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度260 bp。全部引物由上海生物工程有限公司合成，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）純化。

3.2.3 RNA的提取 參照Promega的RNAgents總RNA提取試劑盒，異硫氰酸胍一步法提取，紫外分析儀檢測(cè)濃度及純度，λ260/λ280比值在1.7～2.0之間，達(dá)到了進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）的要求。

3.2.4 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（RT） 每個(gè)反應(yīng)取2μg總RNA，隨機(jī)引物p d（N）62μL和DEPC水，合計(jì)11.6μL混合，70℃熱變性10min，迅速冰浴冷卻3min；加入5×ImProm-Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液4.0μL，ImProm-Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄酶（10U/μL）1.0μL，25m mol/L MgCl22.4μL，dNTP混合物（10m mol/L）1.0μL，混勻，37℃ 90min。

3.2.5 聚合酶反應(yīng)（PCR） PCR的擴(kuò)增體系為25μL，其中包括逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μL，PCR主反應(yīng)液21μL，上/下游引物（10 μmol/L）1 μL，Taq 酶(1U/μL)1 μL。ERα、ERβPCR 反應(yīng)條件：94 ℃ 2min，94 ℃ 1min，60℃1min，72℃45秒。

3.2.6 凝膠電泳分析 取PCR產(chǎn)物5μL，2%瓊脂糖凝膠上電泳，溴化乙錠（EB）染色，應(yīng)用GIS-2010凝膠圖像分析系統(tǒng)照相、讀取灰度值并進(jìn)行分析。

4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。各組數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

5 結(jié)果

5.1 血清E2、FSH、LH的測(cè)定結(jié)果 見(jiàn)表1。

表1 補(bǔ)腎調(diào)沖方對(duì)去卵巢大鼠血清性激素水平影響（±s，n=8）Tab.1 Effectof Bushen Tiaochong decoction on the levelsof serum sex hormone in ovariectom ized rats（±s，n=8）

表1 補(bǔ)腎調(diào)沖方對(duì)去卵巢大鼠血清性激素水平影響（±s，n=8）Tab.1 Effectof Bushen Tiaochong decoction on the levelsof serum sex hormone in ovariectom ized rats（±s，n=8）

注：與去卵巢空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與假手術(shù)組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與乙烯雌酚組比較，○P<0.05。

組別E2（g/L）FSH（IU/L）L H（IU/L）補(bǔ)腎調(diào)沖方高劑量組 5.357±2.416△△○ 2.669±0.596△△○ 3.115±0.793*補(bǔ)腎調(diào)沖方中劑量組 6.583±1.648△△○ 2.567±0.359△△○ 3.019±0.735*補(bǔ)腎調(diào)沖方低劑量組 4.398±1.425△△○ 2.681±0.271△△○ 3.371±0.586△已烯雌酚組 9.468±2.029** 2.116±0.335** 3.062±0.683*去卵巢空白組 4.391±1.558△△ 2.758±0.388△△ 3.982±0.589△△假手術(shù)組 11.676±3.994** 1.770±0.448** 2.533±0.826**

結(jié)果表明大鼠切除卵巢后，外周血E2水平明顯降低，與假手術(shù)組比較有顯著性差異（P＜0.01）；已烯雌酚組大鼠血清E2水平升高，與假手術(shù)組比較無(wú)顯著性差異（P>0.05）；補(bǔ)腎調(diào)沖方組血清E2水平有升高趨勢(shì)，與去卵巢空白組比較無(wú)顯著性差異（P>0.05）；補(bǔ)腎調(diào)沖方組與已烯雌酚組比較有顯著性差異（P<0.05）。

大鼠切除卵巢后，外周血FSH水平升高，與假手術(shù)組比較有顯著性差異(P<0.01)；已烯雌酚組大鼠血清FSH水平降低，與假手術(shù)空白組比較無(wú)顯著性差異（P>0.05）；補(bǔ)腎調(diào)沖方組血清FSH水平有降低趨勢(shì)，與去卵巢空白組比較無(wú)顯著性差異（P>0.05）；補(bǔ)腎調(diào)沖方組與已烯雌酚組比較有顯著性差異（P<0.05）。

大鼠切除卵巢后，外周血LH水平升高，與假手術(shù)組比較有顯著性差異（P＜0.01）；補(bǔ)腎調(diào)沖高、中劑量方組和已烯雌酚組大鼠血清LH水平降低，與假手術(shù)組比較無(wú)顯著性差異（P>0.05）；補(bǔ)腎調(diào)沖方低劑量組和去卵巢空白組比較無(wú)顯著性差異（P>0.05）；補(bǔ)腎調(diào)沖方組與已烯雌酚組比較無(wú)顯著性差異（P>0.05）。

5.2下丘腦ERα、ERβmRNA的測(cè)定結(jié)果 半定量RT-PCR產(chǎn)物電泳分析見(jiàn)圖 1、2。以管家基因G3PDH為參照，分析ERα、ERβ在各組間的不同表達(dá)。

表2 補(bǔ)腎調(diào)沖方藥對(duì)去卵巢大鼠下丘腦 ERα、ERβm RNA 的影響（±s，n=8）Tab.2 Effectof Bushen Tiaochong decoction on the ERα,ERβm RNA in the hypothalamus in ovariectom ized rats（±s，n=8）

表2 補(bǔ)腎調(diào)沖方藥對(duì)去卵巢大鼠下丘腦 ERα、ERβm RNA 的影響（±s，n=8）Tab.2 Effectof Bushen Tiaochong decoction on the ERα,ERβm RNA in the hypothalamus in ovariectom ized rats（±s，n=8）

注：與去卵巢空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與假手術(shù)組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

組別 ERα/G3PDH ERβ/G3PDH補(bǔ)腎調(diào)沖方高劑量組 0.714±0.216** 0.870±0.126**補(bǔ)腎調(diào)沖方中劑量組 0.783±0.193** 0.887±0.082**補(bǔ)腎調(diào)沖方低劑量組 0.325±0.128△△ 0.838±0.084**已烯雌酚組 0.569±0.179** 0.819±0.053**去卵巢空白組 0.220±0.073△△ 0.603±0.138△△假手術(shù)組 1.093±0.169** 0.921±0.130**

去卵巢空白組大鼠下丘腦ERαmRNA明顯降低，與假手術(shù)組比較有顯著性差異（P<0.01）；補(bǔ)腎調(diào)沖方高、中劑量組、已烯雌酚組表達(dá)增加，與去卵巢空白組比較有顯著性差異（P<0.01）；補(bǔ)腎調(diào)沖方低劑量組與去卵巢空白組比較無(wú)顯著性差異（P>0.05），與假手術(shù)組比較有顯著性差異（P<0.01）；補(bǔ)腎調(diào)沖方高、中劑量組與已烯雌酚組比較無(wú)顯著性差異（P>0.05）。

去卵巢空白組大鼠下丘腦ERβmRNA降低，與假手術(shù)組比較有顯著性差異（P<0.01）；補(bǔ)腎調(diào)沖方組、已烯雌酚組能增加去卵巢大鼠下丘腦ERβmRNA表達(dá)，與去卵巢空白組相比較有顯著性差異（P<0.01），與假手術(shù)組比較無(wú)顯著性差異（P>0.05）；補(bǔ)腎調(diào)沖方組與已烯雌酚組比較無(wú)顯著性差異（P>0.05）。

6 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腎-天癸-沖任對(duì)女性生殖機(jī)能調(diào)節(jié)起著重要作用，其中沖任二脈的盛通乃是婦女產(chǎn)生經(jīng)、孕、產(chǎn)、乳的先決條件，而腎氣的盛衰是決定沖任盛衰的關(guān)鍵。絕經(jīng)前后腎氣漸衰，或受稟賦不足，或房勞多產(chǎn)等因素影響，導(dǎo)致腎臟虛衰，沖任虧損，天癸漸竭，陰精耗傷，陰陽(yáng)平衡失調(diào)，臟腑功能紊亂而出現(xiàn)絕經(jīng)前后諸癥，故韓冰教授以補(bǔ)腎調(diào)沖法作為治療更年期綜合征的基本法則，貫穿于治療始終[1]。補(bǔ)腎調(diào)沖方中菟絲子甘、辛，其性平，補(bǔ)而不滯、守而不走，具有補(bǔ)腎養(yǎng)肝，陰陽(yáng)兩調(diào)、精氣并補(bǔ)之功效；黃精甘、平，可“補(bǔ)虛填精”（《滇南本草》），“平補(bǔ)氣血而潤(rùn)”（《本草從新》）；熟地黃味甘，微溫，“能補(bǔ)腎中元?dú)狻保ā侗窘?jīng)逢原》），補(bǔ)任脈之陰；肉蓯蓉性味甘溫，具有補(bǔ)腎壯陽(yáng)、填精補(bǔ)髓、養(yǎng)血潤(rùn)燥等功效，可以補(bǔ)沖任之氣；當(dāng)歸甘、辛、溫，可養(yǎng)血滋肝，調(diào)經(jīng)固沖；川芎辛、溫，具活血行氣、調(diào)經(jīng)之功，兩者可調(diào)補(bǔ)沖任之氣血。全方具有溫補(bǔ)腎陽(yáng)、滋養(yǎng)腎陰、調(diào)理沖任、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)的功效。

下丘腦-垂體-卵巢軸（H-P-O軸）是女性性腺軸，研究表明：卵巢機(jī)能衰退較快或比較突然，雌激素水平突然下降或下降迅速，以致植物神經(jīng)系統(tǒng)不能很好的適應(yīng)而發(fā)生機(jī)能紊亂導(dǎo)致更年期綜合征，所以筆者選用去卵巢大鼠作為更年期模型。更年期的機(jī)能紊亂伴隨著腦尤其是下丘腦神經(jīng)元和功能的紊亂[2]。下丘腦是神經(jīng)內(nèi)分泌高級(jí)整合中樞，同時(shí)也接受卵巢分泌的性激素的調(diào)控。雌激素的生物學(xué)作用由ER介導(dǎo)，在下丘腦ER分布廣泛，尤其是在H-P-O軸上[3]。雌激素受體有α、β兩種亞型，在更年期大鼠下丘腦中ERα、ERβ蛋白表達(dá)量明顯下降[4]。ERmRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯對(duì)ER表達(dá)起著重要的作用。本研究結(jié)果顯示，大鼠去卵巢后，由于血中E2水平下降，解除了對(duì)下丘腦和垂體的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，導(dǎo)致FSH和LH水平的升高；同時(shí)對(duì)ER的正相調(diào)節(jié)作用減弱，使下丘腦ERα、ERβmRNA表達(dá)降低。激素補(bǔ)充治療能夠有效緩解更年期癥狀，但因有禁忌證及長(zhǎng)期使用存在的潛在風(fēng)險(xiǎn)性，而使臨床應(yīng)用受到一定局限。韓冰教授在深入研究中醫(yī)典籍的基礎(chǔ)上，結(jié)合多年臨床實(shí)踐，運(yùn)用補(bǔ)腎調(diào)沖方治療更年期綜合征等多種功能失調(diào)性卵巢疾病，取得了顯著療效。研究結(jié)果顯示補(bǔ)腎調(diào)沖方雖未能明顯提高血清E2水平，但可能通過(guò)降低LH水平，改善去卵巢大鼠性激素水平，同時(shí)上調(diào)去卵巢大鼠下丘腦ERα、ERβmRNA 的表達(dá)，使 ERα、ERβ 合成增加，從而提高ER的生物效應(yīng)，降低了更年期綜合征的發(fā)生。但是否與通過(guò)增強(qiáng)下丘腦芳香化酶催化雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素能力，從而提高了下丘腦局部雌激素的含量有關(guān)，有待進(jìn)一步探討。

[1]孫文墅.韓冰教授補(bǔ)腎調(diào)沖法治療婦科疾病經(jīng)驗(yàn)[J].天津中醫(yī)，1992，9（1）：6-8.

[2]林守清，林 萍，姜玉新，等.絕經(jīng)后卵巢和子宮萎縮及血雌二醇降低的觀察[J].中華婦產(chǎn)科雜志，1997，32（9）：524－527.

[3]師莉莉，薛曉鷗，姜恩魁.雌激素受體與女性生殖軸關(guān)系的研究進(jìn)展[J].錦州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，25（6）：47－49.

[4]紀(jì) 中，崔清志，田艷君，等.益坤寧對(duì)圍絕經(jīng)期大鼠下丘腦雌激素受體表達(dá)的影響[J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2009，19（8）：58－60，80.

Effectsof the Bushen Tiaochong decoction on the levelsof serum sex hormone and the expression levelsof estrogen receptorsα,β m RNA in the hypothalamus in ovariectom ized rats

DUYong-Hong，LIPei-lin，HANBing
（The Second Affiliated Hospitalof Tianjin University of TCM,Tianjin 300150,China）

[Objective]To investigate the effectsof the Bushen Tiaochong decoction on the levelsofserum sex hormone and the expression levels ofestrogen receptorsα,β (ERα,ERβ)mRNA in the hypothalamus in ovariectomized rats.[Methods]Sham operation group wasconsidered ascontrol,castrated ratswere divided into fourgroups:ovariectomized blank group,Bushen Tiaochong decoction high dose group,moderate dose,low dose group,Diethylstilbestrol group.The levels of serum E2,FSH,LH were determraed by radioimmunoassay method,and the RT-PCRmethod wasused to detect the expression levelsof ERα,ERβ mRNA in the hypothalamus.[Results]The levels of serum FSH,LH in ovariectomized ratswas higher aswell as the levels ofestrogenic and ERα,ERβ mRNA in the hypothalamuswas lower.Bushen Tiaochong decoction group on the levelsofserum estrogenic in ovariectomized ratshasa rising trend and the levelsof FSH has a declining trend.Bushen Tiaochong decoction reduced the levels of serum LH and increased the expression levels ofα,βmRNA in the hypothalamus.[Conclusion]Bushen Tiaochong decoction improve the levelsofsex hormones in ovariectomized rats and through increasing the expression levelsofERα,ERβ mRNA to improve ER biologicaleffectsand reduce the occurrence ofmenopausalsyndrome.

Bushen Tiaochong decoction；ovariectomized rats；sex hormone；hypothalamus；estrogen receptor

R692.5

A

1672-1519(2011)03-0240-04

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81072837）。

杜永紅（1970-），女，博士，主治醫(yī)師，研究方向婦科內(nèi)分泌。

2011-02-03）